儲存于 -20?C.

1.       概述

本產(chǎn)品利用特殊的重組原理，不依賴于連接酶,，可實現(xiàn)簡單,、快速、高效的DNA定向克隆,。載體可通過任意方法線性化,，然后與兩端含有15~25bp載體同源區(qū)域的PCR片段重組，反應時間短,，重組效率>95%,，并可實現(xiàn)多至5個片段的高效無縫克隆,。

2.   優(yōu)勢        

l                      可插入任意載體的任意位置

l                      一步，簡單,，準確,，快速地進行多片段定向克隆，反應僅需15min,，效率高達95%

l                      不依賴于連接酶,，PCR產(chǎn)物無需酶切，無需磷酸化

l                      無縫連接,，不引入額外序列

3.       克隆實驗流程

I:        載體線性化,，可酶切或通過PCR方法

II:        目的片段制備，PCR產(chǎn)物5’和 3’最末端的序列分別和線性化克隆載體兩末端序列wanquan一致

III:        載體,，目的片段按摩爾比~1:3與克隆試劑混勻,，50°C孵育15~30min

IV:        反應產(chǎn)物轉化

4.       具體克隆實驗操作

I:        載體線性化

線性化載體是克隆成功的重要前提，可通過酶切獲得,，平末端或者粘末端均可,，雙酶切更有利于降低背景；也可提供PCR擴增獲得,，高保真DNA聚合酶可避免產(chǎn)生不必要的突變,。

II:        引物設計

目的片段擴增所需的正反向引物除含有與自身匹配的特異性序列外，均需含有與載體末端同源的15~25bp重疊序列,，如需添加酶切位點,，接頭序列，標簽序列等,，可添加在二者之間,。即：

PCR Forward Primer = 載體正向overlap序列(15~25bp)+中間酶切位點等序列+目的片段正向特異性序列(20~25bp)

PCR Reverse Primer = 載體反向overlap序列(15~25bp)+中間酶切位點等序列+目的片段反向特異性序列(20~25bp)

若要克隆多個目的片段，片段間引物設計原理與上相同,。

III:        目的片段制備

目的產(chǎn)物需選用高保真DNA聚合酶進行擴增,，由于PCR引物通常較長，退火溫度可根據(jù)特異性區(qū)Tm值及聚合酶本身確定,。

IV: 克隆反應體系

反應物輕輕混勻后,，50°C 15~30min。反應結束后可直接用于后續(xù)轉化或者-20°C保存?zhèn)溆谩?/span>

注：1）重組片段為2~3段時,，載體與各片段加入量約為0.02 – 0.5 pmols,，重組片段為4~6段時，載體與各片段加入量約為0.2 – 1 pmols,，載體與加入目的片段的zuijia摩爾比為1:3

2）重組片段較多時，可適當延長反應時間至1h

V:        轉化

1.  把感受態(tài)細胞置于冰中解凍,；

2.  加入用于轉化的重組反應產(chǎn)物20μl ,，冰中放置30min后,，42℃ 熱激60～90s；

3.  繼續(xù)冰上放置2min,；

4.  添加 500 μl S.O.C 或者 LB培養(yǎng)基,， 37?C 搖床培養(yǎng) 1 h；

5.  將轉化菌液離心后棄上清,，輕輕將 沉淀懸浮后均勻涂布于含有適宜抗性的LB平板上,；

6.  37?C 倒置過夜培養(yǎng)

5.       注意事項