產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

腫瘤組織消化液

紅細(xì)胞裂解液

類器官消化液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體,，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基,。以下是準(zhǔn)備 10mL Complete medium培養(yǎng)基的示例，如所需量不同,，可相應(yīng)調(diào)整用量,。

1. 冰上解凍肺腺癌類器官培養(yǎng)因子B (50x)和肺腺癌類器官培養(yǎng)因子C(250x)。

注意： 解凍后，建議將肺腺癌類器官培養(yǎng)因子B (50x)和肺腺癌類器官培養(yǎng)因子C(250x)分別分裝后保存取用,，避免反復(fù)凍融,。

2. 將 200uL肺腺癌類器官培養(yǎng)因子B (50x)，40uL 肺腺癌類器官培養(yǎng)因子C(250x) 加至9.76mL肺腺癌類器官培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,，充分混合,，配制成 10mL肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基。

注意：配制后的肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲(chǔ)存,，建議在兩周內(nèi)使用,。肺腺癌類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

患者來源的肺腺癌類器官的原代培養(yǎng)

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī),。在收集主要人體組織材料之前,，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級(jí)組織中建立類器官

1.用離心管將原發(fā)性人肺腺癌組織碎片收集在冰冷的原發(fā)組織儲(chǔ)存溶液中,。將組織樣品保持在4°C,，直到分離開始。

2.評(píng)估獲得的組織碎片是否Complete medium由上皮組成,。 如果存在脂肪或肌肉組織,，請(qǐng)?jiān)诮馄曙@微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織,，請(qǐng)立即繼續(xù)下一步,。

3.用肺腺癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗組織兩次。

4.使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀將組織切碎成1-3mm³的小碎片,，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,。

5.在37°C下用10mL腫瘤組織消化溶液在15mL離心管中消化組織片段,，消化時(shí)間可變,，從30分鐘到1.5小時(shí)不等。仔細(xì)監(jiān)測(cè)消化過程,，可適當(dāng)吹打取上清觀察消化程度,。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時(shí)，消化過程即完成,。

6.將FBS加入組織消化混合物中,，最終濃度為2%，并使用100μm細(xì)胞過濾器過濾,。

7.收集并在4°C下以250g離心過濾的細(xì)胞3分鐘,。  在可見的紅色沉淀的情況下，吸入上清液,，并使用2mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀,，在室溫下裂解紅細(xì)胞1分鐘，并在4°C下以250g離心3分鐘。

8.吸出上清液并將沉淀重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,，在4°C下以250g離心3分鐘,，再次重復(fù)此步驟。

9.吸出上清液并將沉淀重懸于基質(zhì)膠中,?；|(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過程,。使用的基質(zhì)膠的量取決于顆粒的大小,。大約10，000個(gè)細(xì)胞應(yīng)接種在25 μ L基質(zhì)膠中,。

10.關(guān)鍵：不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積））,，因?yàn)檫@可能會(huì)抑制固體液滴的正確形成。

將含有類器官的基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的底部,，每個(gè)液滴圍繞孔中心約30 μ L,。

關(guān)鍵：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板,，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會(huì)在試管或移液器吸頭中凝固,。不要讓基質(zhì)顆粒接觸管壁。

11.將培養(yǎng)板放入37°C和5%CO ₂的培養(yǎng)箱中15-25分鐘,，讓基質(zhì)凝膠固化,。

12.準(zhǔn)備所需量的肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基。

13.一旦基質(zhì)膠滴凝固（15-25分鐘）,，打開板并小心地向每個(gè)孔中加入500 μ L肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基,。

關(guān)鍵：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu),。

14.將培養(yǎng)板置于37°C和5%CO ₂的恒溫培養(yǎng)箱中,。

15.每隔3-4天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基,，并用新鮮的預(yù)熱的類器官Complete medium培養(yǎng)基代替它,。

16.密切監(jiān)測(cè)類器官生長狀態(tài)，理想情況下,，肺腺癌類器官應(yīng)在 7 至 10 天內(nèi)建成,。

肺腺癌類器官的傳代培養(yǎng)

1. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng) 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中,。

2. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液,，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3.250g 離心力室溫離心 3min,。

4.棄上清,，使用類器官消化液或用機(jī)械破壞,。對(duì)于使用類器官消化液的細(xì)胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液,，移液器反復(fù)上下吹打并置于37°C孵育,，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復(fù)上下吹吸8次,，以幫助破壞類器官,。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時(shí)間最短。如發(fā)生機(jī)械故障,，在1.5 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸類器官懸液,。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復(fù)上下30次,，這將有助于消化,。

警告:不要在類器官解離液中解離超過7分鐘，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致較差的類器官的生長甚至破壞,。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),，如果是小塊細(xì)胞的混合物，可以觀察到由10-50個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),，消化就完成了,。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行一次沖洗,，然后室溫下250g離心3分鐘,。

6. 棄上清，用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀,，重懸后置于冰上,，重懸時(shí)間不超過 30s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央,，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30uL 左右,。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固,，此步驟應(yīng)盡快完成,。

7. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中,，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

9. 配制肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基,。

10. 待基質(zhì)膠Complete medium凝固后,，加入已配制好的人肺腺癌類器官Complete medium培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL,。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，直到類器官需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),。