05-200-1A MSC NutriStem® XF Medium無血清培養(yǎng)基
- 公司名稱 上海昊則生物科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號 05-200-1A
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 代理商
- 更新時間 2023/6/25 16:46:28
- 訪問次數(shù) 2032
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 食品/農(nóng)產(chǎn)品,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥,綜合 |
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間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基
MSC NutriStem® XF Medium
以色列BI（Sartorius）MSC無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品說明書：
一,、目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
二,、材料：新生兒臍帶
三,、主要儀器：醫(yī)用手術(shù)器械，生物安全柜,，CO2培養(yǎng)箱,，6孔培養(yǎng)板，T25培養(yǎng)瓶
四、試劑：
表1 MSC NutriStem® XF Medium
| 用途 | 品牌 | 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
| MSC培養(yǎng)基 | Biological Industries | 05-200-1A | MSC NutriStem® XF Basal Medium MSC無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 500ml | 4℃ |
| Biological Industries | 05-201-1U | MSC NutriStem® XF Supplement MSC無血清添加劑 | 3ml | -20℃ | |
| 細(xì)胞貼壁 | Biological Industries | 05-752-1H | MSC Attachment solution (100X) MSC貼壁試劑 | 1 ml | 4℃ |
| Biological Industries | PLTGOLD010R | PLTGold® Human Platelet Lysate 血小板裂解物** | 10ml | -20℃ | |
| **已知血小板裂解物含有大量的外泌體,，用戶可依照實驗?zāi)康倪x用合適的貼壁試劑,。 | |||||
| 細(xì)胞傳代 | Biological Industries | 03-079-1A | Recombinant Trypsin-EDTA Solution -EDTA | 500ml | RT |
| Biological Industries | 03-048-1C | Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆抑制劑 | 20 ml | -20℃ | |
| Biological Industries | C3590-0500 | DPBS (w/o Ca & Mg) | 500 ml | RT | |
| DPBS緩沖液 | |||||
| 輔助試劑 | Biological Industries | 05-713-1B | NutriFreez® D10 Cryopreservation Medium | 100 ml | 4℃ |
| D10 凍存液 | |||||
| Biological Industries | C3420-0100 | Penicillin-Streptomycin Solution (100X)青鏈雙抗 | 100ml | -20℃ | |
| VivaCell | C3501-0010 | MSC ACF Tissue Digestive Mix 高效原代干細(xì)胞分離液 | 100m | -20℃ | |
五、實驗前準(zhǔn)備：
5.1培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
5.1.1凍存的MSC NutriStem® XF Supplement在室溫或2-8℃解凍,，避免反復(fù)凍融,。
5.1.2配制：MSC NutriStem® XF Basal Medium（培養(yǎng)基）：MSC NutriStem® XF Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存,，2周內(nèi)使用,。
注1：雙抗非必須，建議原代（P0）時使用,。
注2：培養(yǎng)基含L-Glutamine,，貯藏時避免長期照光。
5.2包被培養(yǎng)皿
或跳過此步驟,，直接加2%血小板裂解物,，促進(jìn)MSC細(xì)胞貼壁與生長。
如果使用05-752-1H,，參考如下步驟：
5.2.1使用DPBS溶液（BI, Cat# 02-023-1A）,，將MSC貼壁試劑稀釋100倍（1:100）。
5.2.2參照表3,，加入適量的1X MSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板,。
表3 涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-752-1）
| 培養(yǎng)器皿 | 表面積cm2/孔或瓶 | 1X MSC貼壁試劑使用體積 |
| 96孔板 | 0.34 | 0.05~0.1 ml |
| 24孔板 | 1.9 | 0.2~0.4 ml |
| 12孔板 | 3.9 | 0.4~0.8 ml |
| 6孔板/ 35 cm培養(yǎng)皿 | 9.6 | 1~2 ml |
| T25瓶/ 60 cm培養(yǎng)皿 | 25 | 2.5~5 ml |
| T75瓶 | 75 | 7.5~15 ml |
注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲存，需在一周內(nèi)使用,。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量,，經(jīng)過實驗測試后可減半使用）
注2：包被期間， 注意包被液不可以干掉,！
5.2.3輕輕搖動培養(yǎng)皿,，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿,。
5.2.4在2-8℃孵育過夜,；或者在CO2培養(yǎng)箱，37℃,，至少孵育30分鐘,。
5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑，再用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿,，即可接種細(xì)胞,。
如果使用05-760-1-15，參考如下步驟：
5.2.1使用生理鹽水,，將NutriCoat™ 促貼壁試劑稀釋500倍（1:500）,。
5.2.2參照表4,，加入適量的1X NutriCoat™ 促貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。
表4 涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-760-1-15）
| 培養(yǎng)器皿 | 表面積cm2/孔或瓶 | 1X NutriCoat™ 促貼壁試劑使用體積 |
| 96孔板 | 0.34 | 0.1 ml |
| 24孔板 | 1.9 | 0.5 ml |
| 12孔板 | 3.9 | 1 ml |
| 6孔板 | 9.6 | 2.5 ml |
| T25瓶 | 25 | 6.5 ml |
| T75瓶 | 75 | 19 ml |
注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲存,，需在一周內(nèi)使用,。
注2：包被期間，注意包被液不可以干掉,！
5.2.3輕輕搖動培養(yǎng)皿,，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿,。
5.2.4在2-8℃孵育過夜,；或者在CO2培養(yǎng)箱，37℃,，至少孵育1小時,。
5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑，用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿（或不需要清洗）,，即可接種細(xì)胞,。
5.3制備1X大豆抑制劑
5.3.1使用無菌的DPBS,，將50X大豆抑制劑（03-048-1C）稀釋成1X,。
注1：抑制重組消化建議方法：第一種使用大豆抑制劑；第二種使用PBS/DPBS清洗（2倍重組量）吹打, 離心去上清,；第三種使用維持培養(yǎng)基抑制,。
六、使用范例：
6.1 UC-MSC原代培養(yǎng) （組織塊法）
6.1.1無菌條件下取新鮮臍帶,，用DPBS漂洗凈血跡
注1： 一般臍帶取得非無菌環(huán)境,，可以稍微用75%酒精潤洗。
6.1.2置10cm 培養(yǎng)皿中,，剪成1~2cm臍段,，剔除血管，用DPBS洗凈血跡,，再剪成1mm3組織塊,。(圖 1)
6.1.3用無菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個孔中。
6.1.4 37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱孵育 30min,，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上。
6.1.5 向每孔滴加0.8ml 培養(yǎng)基 (注意沿孔壁小心滴加,，勿使沖動組織塊),。
6.1.6 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育過夜,，次日 (D1) 每孔再補(bǔ)加1ml 培養(yǎng)基,。
6.1.7 37℃,，5% CO2 繼續(xù)培養(yǎng)，5天 (D6) 后半量換液 (此時一般看不到細(xì)胞,，但最快3天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出),。
6.1.8再過5天后半量換液 (此時一般會有細(xì)胞爬出，但最晚可到14天會出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出) (圖2,、圖3),。
6.1.9每2天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2~4天,，待細(xì)胞融合度（Confluency）達(dá)到約80%后傳代培養(yǎng)(圖4),。
注1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動作要盡可能輕微,，避免沖動組織塊,。培養(yǎng)基加量不能太多，以免組織塊漂浮,。
注2：為增加成功率,，從原代分離臍帶和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)基可加2.0 % PLTGold® 血小板裂解物。
6.2 UC-MSC原代培養(yǎng) （消化法）
MSC NutriStem® 無血清培養(yǎng)基也能有效地培養(yǎng)消化法取得的原代細(xì)胞,，操做方式如下：
6.2.1 將臍帶用DPBS漂洗干凈,，剪成1-50px,后剔除血管。
注1：一般臍帶取得非無菌環(huán)境,，可以稍微用75%酒精潤洗,。
6.2.2剪成3-5mm3后，移入50ml離心管,，再加入的分離液,。
注1：一條長度10公分的臍帶建議加入10ml的分離液；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1,。
注2： 視情況而定,，可自行在分離液中添加1%青鏈雙抗（BI, Cat# 03-031-1B）。
6.2.3把50ml離心管橫放在37度細(xì)胞培養(yǎng)箱,，過夜反應(yīng)（16小時）,。
注1：若總反應(yīng)體積較大，也可持續(xù)旋轉(zhuǎn)混合,。
6.2.4加入和分離液等體積的0.05?TA（BI, Cat#03-015-1B）終止反應(yīng)后,，1500 xg離心5分鐘，去除上清,。
注1：溶液比較濃稠,，小心不要影響下層的細(xì)胞;建議留下5ml左右的溶液。
注2： 若是脂肪組織,，沒有粘稠的情形,，以常規(guī)的200-300 xg離心即可,。
注3：沒有EDTA, 可使用無鈣鎂DPBS取代；此時建議后面步驟6多重復(fù)2-3次,，以確實去除酵素,。
6.2.5以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細(xì)胞后，500 xg離心5分鐘,，去除上清,。
6.2.6再次以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細(xì)胞后，250 xg離心5分鐘,，去除上清,。
6.2.7用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種P0代細(xì)胞培養(yǎng),。
注1：消化后的原代細(xì)胞,，建議培養(yǎng)時接種密度提高到10,000/cm2以上；傳代后即可按常規(guī)的接種密度培養(yǎng),。
6.3 UC-MSC傳代培養(yǎng)與凍存
6.3.1待細(xì)胞融和度達(dá)到約80%后進(jìn)行傳代（細(xì)胞不能太密集,，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基,，每孔加適量DPBS輕輕沖洗1次,。
6.3.2根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重-EDTA（貨號：03-079-1A，T25建議使用1ml）,，在37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱作用3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）,。
6.3.3顯微鏡下觀察細(xì)胞脫落后,，使用5-10ml稀釋大豆抑制劑（SBTI, 貨號：03-048-1，1X）,，1000rpm離心3~5min,。
6.3.4謹(jǐn)慎吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊用適當(dāng)體積的培養(yǎng)基懸浮后,，混勻細(xì)胞懸液,。
6.3.5按照所需的比例進(jìn)行傳代或按照5000-6000cells/cm2的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中，放入37℃, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。
6.3.6每2-3天更換一次培養(yǎng)基,，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，參照操作步驟6.3.1~6.3.5做細(xì)胞傳代,；或者參照操作步驟6.3.1~6.3.3收獲細(xì)胞凍存,。
6.3.7細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) D10無血清 凍存液（貨號：05-713-1）中，裝入凍存管,，2~8℃冰箱放置30min,，-80℃冰箱放置 24h,，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。
注1：本方法僅供參考,，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗做合理調(diào)整,。
附圖：（如下是組織塊法，建議客戶可以嘗試消化法）
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圖1剔除臍帶3根動靜脈血管 圖2細(xì)胞從組織塊邊沿爬出
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圖3細(xì)胞快速增殖 圖4傳代時機(jī)成熟
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