Cell Counting Kit-8 簡稱CCK-8 試劑盒,，為MTT 法的替代方法,，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒,?？捎糜谒幬锖Y選、細胞增殖測定,、細胞毒性測定、腫瘤藥敏等試驗,。

使用說明：
一,、制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量時 （測定細胞具體數(shù)量時）
1、先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量,，然后接種細胞,。
2,、按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 3-5 個細胞濃度梯度,，每組 3-6 個復孔,。
3、接種后培養(yǎng)至細胞貼壁,，然后加 CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時間后測定 OD 值,，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（X 軸），OD 值為縱坐標（Y 軸）的標準曲線,。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致,，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間。）

二,、細胞活性檢測

1,、在 96 孔板中接種細胞懸液（100µL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（在 37℃,5% CO2 的條件下）,。

2,、向每孔加入 10µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）,。

3,、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時。

4,、用酶標儀測定在 450nm 處的吸光度,。

5、如果暫時不測定 OD 值,，打算以后測定的話,，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。在 24 小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化,。

三、細胞增值-毒性檢測

1,、在 96 孔板中配置 100 µL 的細胞懸液,。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 24 小時（在 37 ℃，5% CO2 的條件下）,。

2,、向培養(yǎng)板加入 10µL 不同濃度的待測物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6,、12,、24 或 48 小時）。

3、向每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡,，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）,。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基,，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響,。

4,、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時。

5,、用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度,。

6、如果暫時不測定 OD 值,，打算以后測定的話,，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。在 24 小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化,。

活力計算：.

細胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

A（加藥）：具有細胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A（0 加藥）：具有細胞,、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項：

①建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間,。

②白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。

③當使用標準 96 孔板時,，貼壁細胞的最小接種量至少為 1 ,000 個/孔 (100 µL 培養(yǎng)基),。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 ( 100 µL 培養(yǎng)基),。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實驗,，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液,。

④如果沒有 450nm 的濾光片,，可以使用吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450nm 檢測靈敏度最高,。

⑤培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時,，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響,。