mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)品-起發(fā)生物

起發(fā)生物提供mRNA 核苷和酶原料 mRNA合成技術(shù)服務(wù)助力核酸藥物,，向世界產(chǎn)品看齊,。

關(guān)鍵詞  mRNA 核苷 ，mRNA核心原料,，高產(chǎn)量T7酶 ,，高產(chǎn)率mRNA, mRNA合成，mRNA疫苗,，mRNA藥物,，mRNA解決方案，mRNA定制,，mRNA CRO,，N1-UTP（甲基假尿苷），P-UTP,，Pseudo-UTP（假尿苷）

一 mRN藥物簡介

基于mRNA的治療,，簡單來講就是利用化學(xué)修飾后的mRNA分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，利用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自有核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá),，生成機(jī)體所需要的蛋白質(zhì),。上世紀(jì)90年代，mRNA藥效被初步證實(shí),，之后大量的精力投入到了mRNA藥物的研發(fā)中,。

mRNA藥物開發(fā)的主要技術(shù)門檻在于穩(wěn)定性和遞送，若相關(guān)難點(diǎn)能夠得以解決,，mRNA藥物就可作為蛋白質(zhì)補(bǔ)充或替代療法治療相關(guān)疾病,。尤其是隨著癌癥基因測序和抗原表位發(fā)現(xiàn)等技術(shù)的發(fā)展，mRNA藥物也可用于針對腫瘤患者的個(gè)性化治療,，并具有巨大的應(yīng)用潛力,。目前在mRNA腫瘤藥物開發(fā)領(lǐng)域進(jìn)展較快的企業(yè)主要是Moderna、BioNTech和CureVac,。

二,、mRNA合成過程所需原料

（一）國內(nèi)外mRNA X冠疫苗的合成工藝

BioNTech/輝瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工藝如下：

1）BNT162b2–BioNTech/輝瑞

三核苷酸cap1類似物（（m27,3′-O）Gppp（m2'-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下,，通過T7RNA聚合酶對DNA進(jìn)行純化和體外轉(zhuǎn)錄,。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用一步法,，帽子類似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷,。

2）mRNA-1273–Moderna

利用優(yōu)化的T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在體外合成了編碼序列優(yōu)化的mRNA,，尿苷被N1-甲基假尿苷*取代。轉(zhuǎn)錄后,，使用牛痘苗封蓋酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）和痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）將Cap1結(jié)構(gòu)添加到5’端,。通過oligodT親和純化純化mRNA，通過切向流過濾將緩沖液交換到pH為5.0的醋酸鈉中,，無菌過濾,，并在-20°C下冷凍，直到進(jìn)一步使用,。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法,，需要加帽酶的參與，甲基假尿苷取代尿苷,。

3）ARCoV-艾博生物

該mRNA在體外使用T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從質(zhì)粒ABOP-028（GENEWIZ）的線性化DNA模板中產(chǎn)生,，該質(zhì)粒編碼SARS-CoV-2的密碼子優(yōu)化RBD區(qū)域，并包含5’和3‘的未翻譯區(qū)域（UTR）和一條poly-a尾巴,，以未修飾的NTP作為原料和T7聚合酶體外進(jìn)行mRNA的合成,，使用了牛痘加帽系統(tǒng)（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)進(jìn)行加帽。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法,，需要加帽酶的參與,。

（二）mRNA制備過程原料

mRNA制備過程需要用到的主要原料包括質(zhì)粒DNA模板、一系列酶（主要為7種酶）以及底物核苷酸等;

1,、模板DNA所需原料：質(zhì)粒

DNA模板生產(chǎn),，主要是質(zhì)粒的生產(chǎn)。編碼抗原的DNA模板,，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá),，最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒，即得到DNA模板,。目前質(zhì)粒的生產(chǎn)提取和純化工藝很成熟,，可以自建生產(chǎn)線或者外包出去，例如輝瑞自建質(zhì)粒生產(chǎn)工廠,，大部分mRNA企業(yè)外包，Moderna和國內(nèi)企業(yè)目前是外包,。

制備mRNA質(zhì)粒的要求：質(zhì)粒用于制備mRNA,，這類DNA本身不屬于API，DNA需要按照GMP規(guī)范進(jìn)行,，GMP質(zhì)粒要求生產(chǎn)設(shè)備必須是專用的,、符合GMP規(guī)范且配備潔凈間

2,、mRNA體外轉(zhuǎn)錄所需原料：一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)需要一系列酶的參與：mRNAT7聚合酶、無機(jī)焦磷酸酶,、RnaseInhibitor,、加帽酶以及2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7種酶,。

起發(fā)生物提供全線mRNA體外轉(zhuǎn)錄原料 如下表：

2.1轉(zhuǎn)錄過程所需要的酶

RNA聚合酶體系：RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。

T3、T7和SP6RNA聚合酶分別對T3,、T7和SP6噬菌體啟動(dòng)子具有高度的特異性,。將目的基因序列克隆到T7和SP6啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)中，以克隆的DNA為模板體外合成相應(yīng)的RNA,。

T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）【78MRNA-1104】高度特異識(shí)別T7啟動(dòng)子序列,，以含有T7啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以核甘酸（NTP）為底物,，合成與啟動(dòng)子下游的單鏈DNA互補(bǔ)的RNA,。

無機(jī)焦磷酸酶【78MRNA-1109】：加入無機(jī)焦磷酸酶，增加RNA產(chǎn)量,。無機(jī)焦磷酸酶（PPase）可催化無機(jī)焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽,，可以為蛋白、RNA和DNA的生物合成反應(yīng)提供動(dòng)力,，促進(jìn)產(chǎn)物的生成,。在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生大量的無機(jī)焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn),，可以添加無機(jī)焦磷酸酶,，可解除生成的無機(jī)焦磷酸鹽對反應(yīng)體系的抑制。

RNase抑制劑【78MRNA-1103/78DA10001】：防止RNA的降解,。少量RNase在RNA制備過程中引入,，會(huì)導(dǎo)致RNA的降解，污染可能通過實(shí)驗(yàn)過程中使用的槍頭,、試管（離心管）和其他試劑引入,。通常使用RNase抑制劑作為減少和控制此類污染物的預(yù)防措施。

RNase抑制劑能與RNaseA形成1:1復(fù)合體,，抑制RNase活性,，在mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程需要保持mRNA的穩(wěn)定性以保證疫苗高質(zhì)量的生產(chǎn)。

2,、轉(zhuǎn)錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸

mRNA疫苗研發(fā)中常進(jìn)行假尿嘧啶化修飾,，尿嘧啶修飾是豐富的RNA修飾，一般由尿苷的異構(gòu)化產(chǎn)生,，mRNA的假尿嘧啶化修飾主要有三個(gè)功能：改變密碼子,、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答,。

3、加帽和加尾：共轉(zhuǎn)錄加帽/模板加尾,，轉(zhuǎn)錄后加帽/加尾

真核生物體內(nèi)會(huì)對轉(zhuǎn)錄形成的mRNA進(jìn)行加帽,，即在mRNA的5’端添加一個(gè)甲基化的鳥苷酸帽子（m7GPPPN結(jié)構(gòu)），從而保護(hù)mRNA免遭核酸外切酶的攻擊以增加mRNA的穩(wěn)定性,，并且協(xié)助mRNA與核糖體的結(jié)合以促進(jìn)翻譯起始,。生物體內(nèi)的帽子結(jié)構(gòu)有cap0，cap1,，cap2三種形式,，牛痘病毒加帽酶能夠在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基轉(zhuǎn)移酶處理即可得到cap1帽子,。

此外,，5'帽子還參加mRNA前體的剪接，參與mRNA3'末端多聚腺苷酸化,，保證mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定運(yùn)輸,。

加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶

可以將7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端,，大幅提高mRNA的穩(wěn)定性和啟動(dòng)mRNA的翻譯,。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時(shí)之內(nèi)對mRNA進(jìn)行加帽，效率接近100%,。

在mRNA疫苗研發(fā)生產(chǎn)過程中,，mRNA加帽效率和加帽mRNA穩(wěn)定表達(dá)的效率對疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體系加帽的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率大于帽子類似物mRNA的表達(dá)效率,。

加尾酶：Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次摻入到RNA的3末端,，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能夠增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性,、提高翻譯起始效率,、引導(dǎo)mRNA出核。

主要用到的酶：

1）牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】：

2）痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶【78MRNA-1106】

3）Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂貴,，如何替代加帽酶,？

一步法合成mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入“帽子序列”實(shí)現(xiàn)，這種加帽技術(shù)會(huì)將加帽序列反向加在mRNA上,，在反應(yīng)體系中加入5’帽類似物,，可以省一個(gè)加帽酶，以及減少純化步驟,，一定程度上降低成本（尤其是節(jié)省了昂貴的加帽酶成本）,，但相對應(yīng)地，產(chǎn)量較之兩步法（加帽酶參與）減少，因?yàn)榧用泵傅募用毙矢摺?/span>

4,、消除DNA模板：需要DNA酶【78MRNA-1110】

合成后的產(chǎn)物可能會(huì)有DNA殘留，在疫苗開發(fā)階段,，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟,，以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。需要用DNA酶（DNAase將殘留的DNA模板進(jìn)行消除,，在mRNA疫苗生產(chǎn)的過程中對DNA的殘留控制非常嚴(yán)格格,。

三、mRNA高品質(zhì)

3.1 修飾核苷酸/核苷酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量檢測和質(zhì)量控制：

• 良好品質(zhì)：產(chǎn)品純度可達(dá)99%以上,，且批次間質(zhì)量穩(wěn)定,；

• 無動(dòng)物源成分：合成過程中不引入動(dòng)物源成分，降低病毒污染風(fēng)險(xiǎn),；

• 無污染：每批次產(chǎn)品均通過DNA酶,、RNA酶及內(nèi)毒素檢測，確保產(chǎn)品合成過程未引入外源無污染,；

• 表達(dá)效率保證：產(chǎn)品經(jīng)過轉(zhuǎn)錄測試和表達(dá)測試,，轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)活性優(yōu)于同類產(chǎn)品；

• 工業(yè)級(jí)產(chǎn)能：修飾核苷酸產(chǎn)能可滿足工業(yè)級(jí)應(yīng)用,，滿足核酸藥物從藥物開發(fā)到工業(yè)級(jí)生產(chǎn)的不同需求,。

  起發(fā)Pseudo-UTP純度： 99.2%

Me-Pseudo-UTP純度純度99.8%

3.2 酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• mRNA合成酶系列產(chǎn)品，依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量檢測和質(zhì)量控制：

• 良好品質(zhì)：產(chǎn)品純度可達(dá)95%以上,，質(zhì)控精度優(yōu)于國產(chǎn)同類產(chǎn)品,；

• 定量檢測：采用定量檢測方法檢測DNA酶、RNA酶殘留,，精準(zhǔn)定量微量殘留,；

• 雜質(zhì)控制：每批次產(chǎn)品均通過DNA酶、RNA酶殘留檢測,，檢測精度可達(dá)百萬分之一酶活單位,；

• 嚴(yán)防污染：生產(chǎn)過程中不引入動(dòng)物源成分，每批次產(chǎn)品均通過HIV,、HBV,、HCV檢測；

• 活性保證：產(chǎn)品經(jīng)過酶活測試,，酶活達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),。

  RNA酶抑制劑純度100%

   

  

   

  牛痘加帽酶純度99.99%

  
  

   

  T7聚合酶酶純度100%

  
  

  

   

  二氧甲基轉(zhuǎn)移酶純度99.46%