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①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補,，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點,，這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

Bio-Rad-pcr儀 - 工作原理,；
類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。
 每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。

Bio-Rad-熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。
現(xiàn)將其原理簡述如下：
熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團,。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,；PCR擴增時,，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。