MagCapture™外泌體提取試劑盒PS 試劑 

案列*應(yīng)用  

從血清、血漿,、尿液中提取的細(xì)胞外囊泡的分析

從人血清中提取外泌體的產(chǎn)量比較

使用該試劑盒,，超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體，接著用CD9和CD63抗體進行免疫印跡實驗,。

●　檢測抗體

抗CD9兔多抗,，System Bioscience公司
抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

從人EDTA血漿中提取外泌體

分別從1mL的EDTA血漿,、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）,、人血清中提取外泌體,，進行WB檢測（抗Flotillin2抗體）。

●　檢測抗體

抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2）,，BD Bioscience公司

●　使用樣品量

各1mL

各樣品結(jié)果分別對應(yīng)150μL樣品量,。從100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS樣品緩沖液,，全部上樣,。

從人尿液中提取外泌體的回收量比較

1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法,、超離法進行外泌體回收,，并做免疫印跡（WB）檢測（抗CD9抗體）。

●　檢測抗體

抗CD9兔多抗,，System Biosciences公司

●　使用樣品量

各1mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

各樣品結(jié)果分別對應(yīng)150 μL尿液樣品,。從100 μL提取物中取出15 μL，加入5 μL的 4×SDS樣品緩沖液,，全部上樣,。

與傳統(tǒng)沉淀法的功能比較實驗：

分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘?xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基）提取外泌體,，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】

按照試劑盒的操作說明（反應(yīng)時間：3小時）,，從1 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g,，30min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中提取外泌體。

超速離心法

將10 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g,，30 min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）進行超離（110,000×g,，70 min）,，用TBS緩沖液重懸沉淀物后,，再進行超離（110,000×g，70 min）,，回收沉淀部分,。

聚合物沉淀法

從1mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中,，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體,。

※1：110,000×g離心2小時，在不吸到沉淀的前提下回收上清,。

比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果

分別用本試劑盒,、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體,，用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑,。另外,，用終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（2~4×1010 particles），在透射電子顯微鏡進行分析,。 

電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授,、大阪大學(xué) iFReC 中井先生

MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認(rèn)到很多細(xì)胞外囊泡,。

K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的外泌體回收量和純度的比較（無血清培養(yǎng)基）

用PS親和法,、超離法和聚合物沉淀法從K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體）進行實驗,。

*回收量,，不是回收率

●　檢測抗體

  抗CD63小鼠單抗（MEM-259）
  抗Flotillin-2 小鼠單抗（29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1）,，BD Bioscience公司

K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取外泌體的回收量和純度的比較（10%FBS-添加培養(yǎng)基）

用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒,、超離法和聚合物沉淀法，從K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（10% 去外泌體 FBS補充培養(yǎng)基）獲得樣品進行電泳,，用銀染法和WB法（CD63,、Lamp-1和Flotilin-2抗體）進行實驗。同時,，對外泌體提取片段進行質(zhì)譜測定,，比較所有測定的多肽中來自K562細(xì)胞的人來源多肽的比例（由于添加到細(xì)胞培養(yǎng)基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會下降）,。

●　檢測抗體

  抗CD63小鼠單抗（MEM-259）
  抗Flotillin-2小鼠單抗 （29/Flotillin-2）,，BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司
  健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較

實驗數(shù)據(jù)

①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量

通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離,，然后使用microRNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）提取RNA,。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p),、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值,。

相比超離法，PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產(chǎn)量,。

②運用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較

運用PS親和法將EVs從正常人血清中分離,，然后使用microRNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p),、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

對比AGPC法,，使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA