人抗神經(jīng)/節(jié)苷脂抗體(GM1)試劑盒

工作原理

• 間接法：預(yù)先將人抗神經(jīng)/節(jié)苷脂抗體（GM1）捕獲抗原包被在微孔板上,。加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品以及 HRP 標(biāo)記的檢測抗體后，溫育并洗滌,。底物 TMB 在過氧化物酶催化下,，先轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，再在酸作用下變?yōu)樽罱K的黃色,。顏色深淺與樣品中的人抗神經(jīng)/節(jié)苷脂抗體（GM1）呈正相關(guān),，通過酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），即可計算樣品濃度,。

• 雙抗體夾心法：把抗 GM1 抗體包被于酶標(biāo)板,，樣本中的 GM1 抗體與之結(jié)合形成固相抗原復(fù)合物。隨后加入生wu素化的抗 GM1 抗體,，再加入 ABC 復(fù)合物與生物wu素抗體結(jié)合,，形成免疫復(fù)合物。加入 TMB 顯色底物,，顯色情況與樣本中 GM1 抗體含量成正比,，同樣借助酶標(biāo)儀測定 OD 值來定量或定性分析抗體含量。

試劑盒構(gòu)成

• 微孔酶標(biāo)板：已包被抗體或抗原,，為抗原抗體反應(yīng)提供場所,，如 96 孔配置為 12 孔 ×8 條，48 孔配置為 12 孔 ×4 條,。

• 標(biāo)準(zhǔn)品：通常有 6 管,，濃度依次為特定梯度，如 80,、40,、20、10,、5,、2.5 ng/mL ，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

• 樣本xi釋液：用于稀釋樣本,，確保樣本濃度處于試劑盒可檢測范圍內(nèi),，不同規(guī)格試劑盒的體積有所差異，如 96 孔配置為 6mL,，48 孔配置為 3mL,。

• 檢測抗體 - HRP：與樣本中的抗體或抗原結(jié)合，催化底物顯色,，96 孔配置為 10mL,，48 孔配置為 5mL。

• 洗滌緩沖液：一般為 20× 濃縮液,，使用時需按 1：20 用蒸餾水稀釋,，如 96 孔配置的 25mL 濃縮液，可稀釋出 500mL 洗滌液,，用于洗去未結(jié)合的物質(zhì),，減少非特異性反應(yīng)。

• 底物 A,、B：兩者混合后在酶的作用下發(fā)生顯色反應(yīng),，不同規(guī)格試劑盒中兩者的體積一般相同，如 96 孔和 48 孔配置中,，底物 A、B 均為 6mL 和 3mL,。

• 終止液：用于終止顯色反應(yīng),，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，體積與底物 A,、B 對應(yīng),，如 96 孔配置為 6mL，48 孔配置為 3mL,。

• 封板膜,、說明書、自封袋：封板膜用于在溫育過程中防止液體蒸發(fā)和外界污染,，一般有 2 張,；說明書詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法、注意事項,、檢測原理等,；自封袋用于保存未使用完的試劑盒組件。

樣本要求

• 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時或 4℃過夜,，然后以 1000×g 離心 20 分鐘,，取上清,。若暫時不檢測，上清可置于 -20℃或 -80℃保存,，但要避免反復(fù)凍融,。

• 血漿：使用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，采集后的 30 分鐘內(nèi),，于 2 - 8℃以 1000×g 離心 15 分鐘,，取上清檢測。保存條件與血清相同,。

• 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH = 7.4) 沖洗組織,，去除殘留血液，稱重后剪碎,。按 1:9（一般比例）的重量體積比,，將剪碎的組織與 PBS 加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。還可通過超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，最后以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清檢測,。

• 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：以 1000×g 離心 20 分鐘,，取上清檢測。保存方式與血清一致,。需注意,，標(biāo)本溶血會影響檢測結(jié)果，溶血標(biāo)本不宜用于此項檢測,。

操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：從冷藏環(huán)境取出試劑盒后,，在室溫平衡后方可使用。按 1：20 用蒸餾水稀釋 20× 洗滌緩沖液,。準(zhǔn)備好酶標(biāo)儀（450nm 檢測波長濾光片,，570nm 或 630nm 校正波長濾光片）、高精度加樣器及對應(yīng)槍頭,、37℃恒溫箱等器材,。

2. 加樣：從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃,。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL；樣本孔中加入待測樣本 50μL,；空白孔不加,。

3. 溫育與結(jié)合：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體 100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min,。

4. 洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置 1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。

5. 顯色：每孔加入底物 A,、B 各 50μL,，37℃避光孵育 15min。

6. 終止與讀數(shù)：每孔加入終止液 50μL,，15min 內(nèi),，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

性能特點

• 檢測范圍：一般在 2.5 ng/mL - 80 ng/mL,，不同品牌試劑盒會有所差異,，例如上海信裕生物科技有限公司的產(chǎn)品檢測范圍為 1.563 - 100mIU/ml。

• 靈敏度：多數(shù)試劑盒能檢測到小于 0.1 ng/mL 的濃度,，如上海仁捷生物科技有限公司的產(chǎn)品靈敏度可達(dá)此標(biāo)準(zhǔn),，上海信裕生物的產(chǎn)品最小可測人 Anti - Ganglioside M1 Antibody 達(dá) 0.938mU/ml。

• 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

• 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ，板間變異系數(shù)小于 15% ,，保證了不同批次實驗結(jié)果的可靠性