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Bio-RadPCR儀 - 技術(shù)原理,；
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。
 
但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不僅操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。
 
1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時,，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高 效液相分離開來,，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板,。
 
2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高 效液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
 
3）PCR－ELISA法：利用或生物素等標(biāo)記引物,，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根酶結(jié)合物，終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗,，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
 
2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用
 
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測,，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時,，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗,，所得結(jié)果有很大差異,，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后,，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性,。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法,。
 
建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
 
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個房間操作,。⑵組織培養(yǎng)物,、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA,。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作,，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留,。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠,。⑺任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套,，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換,。實驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間,，經(jīng)常清洗,。
 
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作,，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會,。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行,。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道,。
 
3、建立前PCR區(qū),。
 
該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng),，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染,。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備,，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。