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BioRadPCR儀 - 技術(shù)原理,；

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在聚合酶鏈式反應實驗中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復性,，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也大大降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應用，并逐步應用于臨床,。

1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,，下游引物不標記,。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高 效液相分離開來，分別測定其熒光強度,，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板,。

2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）,。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高 效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。

BioRad內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用；

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,，即PCR到達平臺期后進行檢測,，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差,。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量,。加入內(nèi)標后,，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此,，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法。

制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：

⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作,。

⑵組織培養(yǎng)物,、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA,。

⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,，也不能用作操作靶序列。

⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作,，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留,。

⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。

⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,，而且管子不能用力崩開,，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。

⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套,，手套要經(jīng)常更換,，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換,。實驗服要專門用于樣品準備間，經(jīng)常清洗,。