廣州.北京.武漢eppendorfPCR儀維修服務(wù)中心:

北京eppendorf維修中心:400-115.6785   急修用戶:135-2223.3163

廣州eppendorf維修中心:020-8568.1121  急修用戶:177-2802.3252

武漢eppendorf維修中心:400-115.6785   急修用戶:173-4331.3195

eppendorfpcr儀反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10×擴增緩沖液   10ul 4種dNTP混合物   各200umol/L 引物        各10～100pmol 模板DNA       0.1～2ug Taq DNA聚合酶   2.5u Mg2+       1.5mmol/L 加雙或三蒸水至   100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶,、dNTP,、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。
 理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。
  設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右,。
  ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
  ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。
ATGC好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補,，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。
  ⑤引物3’端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點,，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
  ⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。
  引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。
  酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。
 催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時),，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。
  dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性,。
dNTP溶液呈酸性,，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris,。
HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝， -20℃冰凍保存,。
 多次凍融會使dNTP降解,。
 在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配,。
 濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。
dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,。
  模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本,。
SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白,，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,，再用有機溶劑酚與抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。
 提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng),。
 一般臨床檢測標(biāo)本,，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體,，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接 用于PCR擴增,。
RNA模板提取一般采用異胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,。
  Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時,，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。
Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴增,，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。

eppendorfpcr儀 - 工作原理,；
類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。
 每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。

eppendorfpcr儀熒光化學(xué) 
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。
 現(xiàn)將其原理簡述如下：
1）熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團,。
 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,；PCR擴增時,，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。