TUNEL凋亡顯色法

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發(fā)生凋亡時,，DNA內切酶被激活,，核小體間的基因組DNA被切斷,，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)

加上帶有生物素(Biotin) 標記的dUTP即Bitin-dUTP.,隨后于辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的streptavidin結合， 在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到細胞凋亡,。

實驗意義

1. TUNEL法是一種分子生物學 與形態(tài)學相結合的研究方法,，可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色，可以準確反映細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征,。

2.可用于石蠟切片冰凍切片培養(yǎng)的細胞等進行細胞凋亡檢測,，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。

3.操作簡便快捷,，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用,。

實驗步驟

1.石蠟切片TUNEL顯色法:

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯,，至水劑乙醇;

②PBS漂洗3*5 min; .

③加入蛋白酶K工作液37°C反應15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

④4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑥加入適量TdT酶反應液,，暗濕盒中37°C反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3x5 min; .

⑦浸入0.3% H202封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,，37*C反應30-60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次;

10.選擇是否用DAPI復染細胞核;

脫水,、透明、中性樹膠封片后進行觀察,。

2.冰凍切片TUNEL顯色法:

①新鮮組織經處理后,，立即在恒冷冰凍切片機內切片，厚度為5~6 um;

②防脫玻片,，貼片,，室溫陰干約12 h;

③4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定10 min, PBS漂洗3x5 min;

④浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入邇透液(0.1% Triton X-100溶于PBS中)，室溫通透30 S-2 min;

⑥加入適量TdT酶反應液,，暗濕盒中37°C反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,，PBS漂洗3x5 min; .

⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,，379C反應30-60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次:

@選擇是否用DAPI復染細胞核;

脫水、透明,、中性樹膠封片后進行觀察,。

實驗完成周期及交付標準

1.實驗周期: 1-2周

2.交付標準:蠟塊、切片,、染色圖片.實驗報告(實驗步驟,、試劑、耗材等)

需確認的信息

1.樣本的種屬.

2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)

3.是否提供試劑盒

4.拍照要求

實驗代做服務：