細(xì)胞水平氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙.烯醛的檢測試劑

AcroleinRED

本試劑能與劇毒的不飽和醛——丙.烯醛進(jìn)行特異性反應(yīng),，并通過紅色熒光使其可視化。它不和其他不飽和醛或脂質(zhì)代謝物等進(jìn)行反應(yīng),，因此可以從活細(xì)胞中檢測出內(nèi)源性丙.烯醛或由外部刺激而過量產(chǎn)生的丙.烯醛,，并且可進(jìn)行相對定量。

※本產(chǎn)品基于理化學(xué)研究所開拓研究本部田中生體機能合成化學(xué)實驗室的研究成果商品化而成,。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用,。請勿用于研究以外的其他用途。

◆丙.烯醛是什么,？

丙.烯醛（Acrolein,；2-propenal）是具有極其簡單結(jié)構(gòu)的α，β不飽和醛,。因其化學(xué)活性高,，近年來作為氧化應(yīng)激標(biāo)記備受矚目。丙.烯醛的產(chǎn)生源十分廣泛,，具體可分為環(huán)境因素和生理因素,。已知的環(huán)境因素有：烹飪食品時可能產(chǎn)生丙.烯醛（特別是油炸肉或魚,，烘烤或燒焦時等等），以及飲酒,、香煙中的煙霧,、排氣導(dǎo)致丙.烯醛的生成（燃燒有機物）等。另外,，在生理因素方面,，有報道稱丙.烯醛在生物體內(nèi)經(jīng)常作為代謝副產(chǎn)物被合成，如在脂質(zhì)過氧化反應(yīng),，蘇氨酸和蛋氨酸的酶依賴性代謝反應(yīng),，多胺氧化反應(yīng)以及由于細(xì)胞暴露而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

由于丙.烯醛的化學(xué)反應(yīng)活性非常高,，它能與生物體內(nèi)各種親核基團(tuán)結(jié)合（蛋白質(zhì),、核酸和脂質(zhì)等），從而破壞其功能,，因此它作為一種具有強毒性的氧化應(yīng)激標(biāo)記物開始為人們認(rèn)知,。近年研究表明，丙.烯醛的毒性高于有名的氧化應(yīng)激標(biāo)記物,，活性氧（Reactive Oxidative species,；ROS）。它不僅在基礎(chǔ)生物學(xué),，在制藥,、環(huán)境科學(xué)、食品產(chǎn)業(yè),、健康產(chǎn)業(yè)等廣泛地生命科學(xué)領(lǐng)域中也備受矚目,。然而，由于丙.烯醛結(jié)構(gòu)簡單且反應(yīng)活性高,，導(dǎo)致其檢測困難且難以對它進(jìn)行詳細(xì)分析,。

丙.烯醛的結(jié)構(gòu)式

■　傳統(tǒng)的丙.烯醛檢測方式

在傳統(tǒng)法中，想要檢測丙.烯醛十分困難,，通常會利用丙.烯醛的α,，β-不飽和醛結(jié)構(gòu)的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測。以下列舉兩種具有代表性的方法,。

1）檢測FDP

丙.烯醛能與生物體內(nèi)蛋白的胺緩慢反應(yīng)，生成3-甲?；?3,4-脫氫哌啶（FDP）,。通過使用能識別FDP的抗體，間接檢測并定量丙.烯醛的方法得到廣泛應(yīng)用,。然而,，有研究人員提出了該方法的缺點：①畢竟FDP只是眾多丙.烯醛反應(yīng)物中的一種,，憑借抗FDP抗體對丙.烯醛的評價并不充分；②由于 FDP的生成十分緩慢,，無法在高靈敏度下觀察丙.烯醛的生成,。另外，由于使用抗體,，因此不適用于活細(xì)胞實驗（見上圖方法一）,。

2）利用HPLC檢測

通過使用3-氨基丙醇與丙.烯醛發(fā)生選擇性的熒光反應(yīng)，然后使用HPLC熒光分析對具有熒光性的生成物7-羥基喹啉進(jìn)行定量,。但是由于丙.烯醛的高活性和揮發(fā)性,，無法輕易將其分離，生成物的熒光靈敏度低,、通量低,，且無法避免細(xì)胞破裂，無法檢測活細(xì)胞的丙.烯醛含量（見上圖方法二）,。

◆AcroleinRED的原理

AcroleinRED是利用了理化學(xué)研究所田中克典主任研究員等人所發(fā)現(xiàn)的苯基疊氮化合物與丙.烯醛發(fā)生特異性環(huán)化反應(yīng)時所用到的試劑,。

■　苯基疊氮化合物丙.烯醛的特異性反應(yīng)

苯基疊氮化合物與丙.烯醛特異性地且迅速地發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)狀產(chǎn)物4-甲?；?,2,3-三唑啉,。4-甲酰基1,2,3-三唑啉能與附近的生物分子非特異性結(jié)合并形成共價鍵,。

■　利用AcroleinRED檢測丙.烯醛的原理

利用AcroleinRED檢測丙.烯醛的原理可以分為細(xì)胞內(nèi)外兩條途徑,。

①檢測細(xì)胞內(nèi)丙.烯醛

AcroleinRED擁有膜通透性，能夠穿透細(xì)胞膜,，在細(xì)胞內(nèi)與丙.烯醛反應(yīng)并形成4-甲?；?,2,3-三唑啉。

②檢測釋放到細(xì)胞外的丙.烯醛

細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的丙.烯醛被釋放到細(xì)胞外,。丙.烯醛與細(xì)胞外的AcroleinRED迅速反應(yīng),，反應(yīng)生成物4-甲酰基1,2,3-三唑啉通過胞吞進(jìn)入到細(xì)胞中,。

無論是①,，②哪條途徑的反應(yīng)生成物4-甲酰基1,2,3-三唑啉,，都會隨機地與生物分子（蛋白等）反應(yīng),，后在細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞染色。

※    請注意,，本試劑不能用于局部觀察,。由于丙.烯醛與試劑的反應(yīng)生成物以及附加在生物分子的狀態(tài)都會通過熒光

※    信號被檢測出，因此并不能使丙.烯醛局部可視化,。

◆特點

●　AcroleinRED是利用了苯基疊氮化合物與丙.烯醛特異性且迅速發(fā)生反應(yīng)這一原理的試劑,。通過使用TAMRA染料

●　標(biāo)記從細(xì)胞中產(chǎn)生的丙.烯醛,，使丙.烯醛可視化。

●　可使用羅丹明濾光片組件觀察（激發(fā)/熒光波長：560 nm/585 nm）,。

●　不與其他不飽和醛（巴豆醛,，反式2-辛烯醛，異丁烯醛）,、苯乙烯反應(yīng),。

●　無需前處理，簡單地操作即可檢測,。

●　與現(xiàn)有丙.烯醛定量法相比,，靈敏度高。（丙.烯醛濃度的檢測上限：100 nM）

●　可根據(jù)熒光強度相對定量丙.烯醛,。

◆原著論文

●　A. R. Pradipta, M. Taichi, I. Nakase, E. Saigitbatalova, A. Kurbangalieva, S. Kitazume, N. Taniguchi,

●　K. Tanaka, ACS Sens., 1, 623～632 (2016).

●　Uncatalyzed Click Reaction between Phenyl Azides and Acrolein: 4-Formyl-1,2,3-Triazolines as

●　“Clicked” Markers for Visualizations of Extracellular Acrolein Released from Oxidatively Stressed

●　Cells.

●　T. Tanei, A. R. Pradipta, K. Morimoto, M. Fujii, M. Arata, A. Ito, M. Yoshida, E. Saigitbatalova, A.

●　Kurbangalieva, J. Ikeda, E. Morii, S. Noguchi, and K. Tanaka, Adv. Sci., 1801479 (2018)

●　Cascade reaction in human live tissue allows clinically applicable diagnosis of breast cancer

●　morphology.

◆應(yīng)用

●　穩(wěn)態(tài)下對丙.烯醛產(chǎn)生量進(jìn)行相對定量

●　對因外部刺激（藥劑處理等）導(dǎo)致丙.烯醛產(chǎn)生量變動進(jìn)行相對定量

※    不可用于丙.烯醛的局部觀察,。詳情請瀏覽本文“原理”部分。

◆操作方法概要

1.　使用新鮮的培養(yǎng)基制備AcroleinRED溶液（終濃度10~30 μM）,。

1.　※ 終濃度可能會因為細(xì)胞種類不同而有所差別,，建議根據(jù)實驗進(jìn)行優(yōu)化。

2.　去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基,，用PBS清洗2次,。

3.　添加含有AcroleinRED的培養(yǎng)基。

4.　培養(yǎng)30分鐘~1小時,。

1.　※ 注意：熒光信號會隨處理時間的增加而積累,。請根據(jù)實驗選擇理想的處理時長。

5.　用PBS清洗細(xì)胞3次,，更換新的培養(yǎng)基,。

6.　可以觀察非固定細(xì)胞（活細(xì)胞）及固定細(xì)胞。

◆應(yīng)用實例

■　驗證苯基疊氮化合物的丙.烯醛特異性

■　依賴于氧化應(yīng)激的丙.烯醛的產(chǎn)生量增加

在氧化應(yīng)激模型中,，將0~1,，000 μM的各濃度的過氧化氫H₂O₂添加至HUVEC細(xì)胞中預(yù)孵育2小時后，添加AcroleinRED并在30分鐘后進(jìn)行非固定觀察,。在未添加H₂O₂時可觀察到穩(wěn)態(tài)下丙.烯醛的產(chǎn)生量,。另外，可以發(fā)現(xiàn)隨著H₂O₂濃度的增加,，丙.烯醛的生成量也不斷增加,。

■　ROS產(chǎn)生促進(jìn)劑使丙.烯醛產(chǎn)生量增加

使用能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生的物質(zhì)甲萘醌對細(xì)胞處理0、10,、30,、60分鐘后，分別使用ROS檢測試劑以及AcroleinRED進(jìn)行共染色,?？捎^察到經(jīng)甲萘醌處理后，細(xì)胞的ROS迅速增加,，而丙.烯醛則是緩慢增加,。

■　不同細(xì)胞種類所產(chǎn)生的丙.烯醛產(chǎn)生量比較

使用AcroleinRED對3種正常細(xì)胞以及8種人癌細(xì)胞株進(jìn)行丙.烯醛產(chǎn)生量的相對比較。結(jié)果表明,，與正常細(xì)胞相比,，癌細(xì)胞中丙.烯醛的產(chǎn)生量明顯增加。并且發(fā)現(xiàn)每種癌細(xì)胞的丙.烯醛的產(chǎn)生量之間也有差別,。

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■　組織中丙.烯醛的可視化

將乳腺癌患者來源乳腺組織（IDC,，浸潤性導(dǎo)管癌, DCIS，原位導(dǎo)管癌）以及正常乳腺組織（NBG）提取后立刻以非固定狀態(tài)浸于AcroleinRED（20 μM）/Hochest混合溶液中,，靜置5分鐘后染色丙.烯醛和細(xì)胞核,，清洗組織后使用熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果表明,，AcroleinRED處理過的乳腺癌組織（IDC,，DCIS）中可以觀察到紅色熒光，但正常乳腺癌組織（NBG）卻基本無法觀察到經(jīng)過AcroleinRED處理的染色,。通過這種方法,，可以對非固定狀態(tài)下的提取組織進(jìn)行染色。

◆產(chǎn)品列表