人P16免疫組化試劑盒

人P16免疫組化試劑盒以HRP標記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate,，HRP-SA）為基礎(chǔ)，可用于檢測細胞,、組織內(nèi)的特異性P16抗原,。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強,、定性定位準確,、背景清晰。在所用的P16一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后,，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合，后加入HRP-SA,，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復(fù)合物,，顯微鏡下觀察成像。

注：本產(chǎn)品僅供實驗室科學研究,。本步驟是根據(jù)我們長期實驗得出的有效步驟,，不一定是zui優(yōu)方法，請客戶根據(jù)具體科研實驗情況進行調(diào)整和優(yōu)化,，并歡迎客戶和我們探討,。

試劑盒所含試劑：

試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100   10 mL（選用）

試劑B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL

試劑C （*分裝）已稀釋的即用型P16一抗（2.5ml）

試劑D （*分裝）生物素化羊抗兔IgG 1支

（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml

試劑E HRP-SA復(fù)合物1支（濃度1 μM,，稀釋比1:50~1:200）100 μL

試劑F DAB顯色液 5ml

用戶自備試劑：

1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）

三羥基氨基甲烷1.21g

氯化鈉7.6g

加蒸餾水800mL,，濃鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4，后定容至1000mL

TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）

2．抗原修復(fù)液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）

10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液

檸檬酸0.38g

檸檬酸三鈉2.45g

加蒸餾水900mL,，濃鹽酸調(diào)pH值至6.0,，后定容至1000mL

或：0.5M EDTA修復(fù)液（pH8.0）

EDTA·2H2O 186.1g

檸檬酸三鈉2.45g

加蒸餾水700mL，用10mM NaOH調(diào)pH值至8.0,，后定容至1000Ml

3. 緩沖甘油封固劑10 mL

4. Tween 20 5 mL

石蠟包埋組織切片免疫染色

實驗步驟（建議方案）：

石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度

1.烤片： 將待做切片置于切片架上,，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；

2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ,、Ⅲ）,，每次10 min；

3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化,，無水乙醇5min,，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min,；75%乙醇2min,，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min,；

4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復(fù),，常采用高壓、微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修復(fù)法,，室溫自然冷卻,，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min,，TBS洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù),，直接進入第5步封閉。

5.封閉： 滴加試劑B,，37℃濕盒孵育30 min,；

6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜,；

7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）,；

8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min,；

9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D）,，37℃濕盒中孵育30 min；

10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）,；

11.封閉： 滴加試劑Tween 20,，37℃濕盒孵育封閉20 min；

12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200,，終濃度5~20 nM）,，37℃濕盒中孵育30 min；

13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）,，TBS洗滌（2×5 min）,；

14.顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色；

15.復(fù)染：自來水充分沖洗,，復(fù)染,，脫水,，透明；

16.封片： 待組織標本干后,，用試劑緩沖甘油封固劑封片,；

17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。

注意事項：

1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,，自來水沖洗后方能把切片取出,，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用,。

3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心,，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部,。

4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20,，否則會影響結(jié)果觀察,。

5. 如須復(fù)染細胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片,。

附1：

抗原修復(fù)方法

常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）,、EDTA抗原修復(fù)液（pH8.0或9.0）等等。

一,、酶消化修復(fù)法

切片脫蠟水化處理,，TBS沖洗，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,，37℃孵育20~30min后TBS沖洗即可,。

二、微波抗原修復(fù)法

微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰,，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中,，中檔或高檔繼續(xù)微波10~15min,，取出微波盒冷卻至室溫后，自來水沖洗,，取出切片,。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調(diào)整,。

三,、直接高壓抗原修復(fù)法

取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上,，修復(fù)液沸騰后放入切片架,，蓋上鍋蓋,，待噴氣后計時1.5~2.5min即可脫離熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗,，取出切片,。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。

四,、隔水式高壓抗原修復(fù)法

不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰,，微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中,，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋,，待噴氣后計時4~8 min即可關(guān)閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗,，取出切片,。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。

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