miRNA熒光定量檢測服務(wù)（ realtime fluorescence quantitative PCR,，RTFQ PCR）是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度,?？捎糜趍RNA、microRNA,、lncRNA等基因表達(dá)量的檢測,。

miRNA熒光定量檢測服務(wù)常有兩種檢測方法

　　PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán),。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,；剛開始時, 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時,，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。

　　使用熒光染料SYBR或EVGreen。熒光染料可以結(jié)合到雙鏈DNA上面,，當(dāng)體系中的模板被擴(kuò)增時,，熒光染料可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進(jìn)行,，結(jié)合的熒光染料越來越多,，被儀器檢測到的熒光信號越來越強(qiáng),，從而達(dá)到定量的目的,。

　　5）數(shù)據(jù)分析

　　是一類長度約19-24nt的非編碼單鏈RNA,，通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或*互補(bǔ),，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用,。它廣泛存在于動物,、植物、真菌及病毒的基因組中,，調(diào)控生物體生長發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中相關(guān)基因的表達(dá),。miRNA的異常表達(dá)可能會導(dǎo)致生理狀態(tài)的異常和疾病的產(chǎn)生，在多種癌癥中,，miRNA的表達(dá)水平會發(fā)生明顯改變,，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外,，在許多其他的病變組織和細(xì)胞中也檢測到了miRNA的異常表達(dá),。因此對miRNA的表達(dá)的研究具有重要意義。

　　提供實(shí)驗(yàn)報告,、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法,、實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果、圖表及相關(guān)分析數(shù)據(jù),。

　　miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）,。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì),，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個 核苷酸組成的成熟的 miRNA ,，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中,，這個復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程,。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對決定了這個過程的特異性,。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解,。由于 miRNAs 可以對不*互補(bǔ)的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程,，因而每個 miRNA 可以有多個靶基因,，而幾個 miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個 miRNA 來經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個基因的表達(dá),，也可以通過幾個 miRNAs 的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá),。對于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),。

　　實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑,，利用熒光信號實(shí)時檢測PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。實(shí)時熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速,、高重復(fù)性地定量起始模板濃度,。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個核苷酸組成的小RNA,，長度太短,，并不能通過傳統(tǒng)的實(shí)時定量PCR進(jìn)行檢測,但是通過特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實(shí)時定量PCR引物及探針可以檢測微量樣品中microRNA表達(dá)水平,，也可以用終點(diǎn)PCR法定性檢測,。

　　4.超寬的線性范圍,，可跨越 7 個數(shù)量級,；

樣品保存及運(yùn)輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的RNA會開始降解,。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周,，不會有明顯的RNA降解發(fā)生,。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中,，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個月,，不會有明顯的RNA降解發(fā)生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜,，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去,，再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩(wěn)定保存3～5年。