用于豬瘟病毒診斷的高敏配對單抗上市

• 研究背景

豬瘟病毒是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬,，其RNA為單股正鏈,。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm,，核衣殼是立體對稱二十面體,，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜,。豬瘟病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制,不能凝集紅血球,，與牛腹瀉病毒有相關(guān)抗原。該病毒對**敏感,，對溫度,、紫外線、化學(xué)消毒劑等抵抗力較強(qiáng),。

豬瘟病毒能在豬胚或乳豬脾,、腎、骨髓,、淋巴結(jié),、白血球、結(jié)締組織或者肺組織的細(xì)胞中培養(yǎng),，但在這些細(xì)胞上不產(chǎn)生明顯病變,。可利用雞新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)（END試驗(yàn))測定豬瘟病毒,，作為診斷豬瘟的一種方法,。

臨床診斷方法有：1.動物接種試驗(yàn)易感豬接種是檢測豬瘟病毒的敏感方法。采取發(fā)病豬的血液或病死豬的淋巴結(jié),、脾臟,、扁桃體等組織制成乳劑，無菌處理后接種易感豬（10-20Kg）,，觀察發(fā)病情況,，然后再分離病毒。通常采用兔體交叉免疫試驗(yàn),。2,、檢測血清抗體檢測血清抗體可為豬瘟免疫提供依據(jù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對檢測非典型豬瘟和溫和性豬瘟有重要作用,。3,、檢測豬瘟病毒直接免疫熒光抗體技術(shù)是檢測豬瘟病毒的一種快速診斷方法，該方法是采取豬的扁桃體或者豬腎,、脾等組織做冰凍切片或觸片,，經(jīng)丙酮固定,，熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察,，如果這些組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有亮綠色熒光,，說明細(xì)胞內(nèi)存在豬瘟病毒，即可診為豬瘟,。

   應(yīng)市場需要,，我們山東綠都生物食品安全檢測事業(yè)部歷時(shí)2年時(shí)間，開發(fā)了38株抗豬瘟鼠單抗,，經(jīng)過配對測試,，找出1組可以配對成功，并投入了市場進(jìn)行臨床驗(yàn)證,。

二,，目的意義

1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量,，指導(dǎo)客戶與有關(guān)監(jiān)督部門考核產(chǎn)品,。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷,，可用于扁桃體或者豬腎,、脾等組織用于檢測豬瘟病毒。

• 鼠單抗質(zhì)量鑒定

①免疫熒光鑒定

1.ST細(xì)胞鋪96孔板一個(gè),，同時(shí)接毒,，按照5%接毒，每孔接50ul,。

2.48-120小時(shí)測定熒光,。用0.01Mpbs洗三次后棄掉pbs，拍干,。 3.加入冷乙醇（-20℃存放）固定20分鐘,，放入-20℃后棄掉上清，不拍板,。

4.pbs洗三次,，棄上清，不用拍板,，吸干水分。

5.加入一抗,，按照0.1 mg/ml加入,。37℃防置40分鐘，pbs洗三次,，吸干水分,。

6.加入二抗（按1:40加入,，pbs稀釋）37 ℃防置40分鐘。Pbs洗4次,，吸干水分,，不拍板，觀察,。

7.顯微鏡亮度：1.5亮度

注意：1.做不接毒的空白細(xì)胞對照,。

         2.pbs洗要同一位點(diǎn)加入，要溫柔,。

         3.鋪板同步接毒,。

②膠體金初步鑒定

 18G4標(biāo)記金，10A2 劃線組合,，測定病毒液1:5稀釋,，*。

所開發(fā)試紙條產(chǎn)品顯示： 1,，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量,，可以將油佐劑疫苗冷凍破乳化，但不可以用乙醇和二甲基亞砜等使蛋白變性的有機(jī)溶劑破乳化,。

2,，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎,、脾等組織用于檢測豬瘟病毒,。

配對情況：10A2-18G4    ，推薦10A2劃線,，18G4標(biāo)記金,。

推薦使用濃度： 膠體金： 5微克/ml金液，劃線0.5-1mg/ml

                ELISA： 1：50 000-50 0000

                WB及免疫組化,，免疫熒光：1:50-1：500

③ 特異性,、符合率、穩(wěn)定性,、靈敏度,、假陽性率、假陰性率

特異性： 本配對抗體開發(fā)的試紙條產(chǎn)品只識別豬瘟病毒,與其他病毒無交叉反應(yīng),。

符合率：本試紙條與PCR符合率99%,。

穩(wěn)定性:  本試紙條常溫的保質(zhì)期為36個(gè)月。

靈敏度： 不低于PCR的靈敏度,。

假陽性率： <5%

假陰性率:   0%

四,、配套羊抗鼠二抗與萬能C線反應(yīng)蛋白； CSFV純化標(biāo)準(zhǔn)陽性 抗原,。

五,、產(chǎn)品說明書附錄

生產(chǎn)公司：山東綠都生物科技有限公司

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