大鼠內(nèi)毒素（ET）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用       內(nèi)毒素試劑盒用于測(cè)定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中內(nèi)毒素（ET）的含量,。

實(shí)驗(yàn)原理：

  本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠內(nèi)毒素（ET）水平,。用純化的大鼠內(nèi)毒素（ET）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入內(nèi)毒素（ET）再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠內(nèi)毒素（ET）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中大鼠內(nèi)毒素（ET）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟

1.         標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻,；然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五,、第六孔中，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為0.6Eu/L，0.4Eu/L ,，0.2Eu/L,，0.1Eu/L,， 0.05Eu/L）。

2.         加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。

7.         溫育：操作同3。

8.         洗滌：操作同5,。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

10.     終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.     測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng)：

1．  試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．  濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．  各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4．  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5．  封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6．  底物請(qǐng)避光保存,。

7．  嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．  本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，   

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，根據(jù)樣品的OD     

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)      

準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式,，將樣品的OD值      

代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。

試劑盒性能：

1.樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。

2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和15%

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：,；2-8℃,。

2．有效期：6個(gè)月

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