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康寧 Corning         430659           可立外旋凍存管         2.0ml          50支/包,10包/箱

康寧 Corning       430658         可立外旋凍存管         1.2ml         50支/包,10包/箱

康寧 Corning       430488         可立外旋凍存管         2.0ml         50支/包,10包/箱

康寧 Corning         430663         可立外旋凍存管       5.0ml       50支/包,10包/箱

細胞凍存,、解凍方法與細胞計數(shù)
一,、細胞冷凍保存
1.材料：
生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO(Sigma D-2650),、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene　5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數(shù)盤與蓋玻片,、等速降溫機(KRYO10SeriesII)
2,、冷凍保存方法：
（1）傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase*儲存。
-20℃不可超過1小時,，以防止胞內(nèi)冰晶過大,，造成細胞大量凋落，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。
（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase*儲存,。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存,。
3、步驟：
（1）冷凍前24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基,，使細胞處于指數(shù)生*,。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基,、血清,，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液,，置于室溫下待用,。
（3）離心收集培養(yǎng)之細胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細胞,，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率,。
（4）取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液,，并晃動試管,，制成細胞凍存懸液（DMSOzui后濃度為5～10％），使細胞濃度為1～5×106cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1～2ml/vial,，并取少量細胞懸浮液作污染檢測,。嚴密封口后，注明細胞名稱,、代數(shù),、日期。然后進行凍存,。
4,、注意事項：
（1）欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),，約為80～90％致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生,。
（2）細胞在液氮中可*凍存無*，而不會影響細胞活力,；在-70度可保存數(shù)月,。
（3）注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,，無菌且無色(以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝,，4℃避光保存,，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因*儲存后對細胞會有毒性,。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷,。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應(yīng)高滲,，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化,，可換用10%甘油凍存,。
（4）冷凍保存之細胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高,，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后消失,。
③adherent tumor lines:5～7×106，依細胞種類而異,。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml,。
（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture,，以防止冷凍失敗。
（6）凍存可用10%～90%的血清,，一般高濃度血清有助于維護細胞活力,，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積（4度時）,，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養(yǎng)細胞,，以90%血清凍存更為有效,。

二、冷凍細胞活化
1,、冷凍細胞之活化原則為快速解凍,，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之si亡,。
2,、細胞活化后，約需數(shù)日,，或繼代一至二代,，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3,、材料
37℃恒溫水槽,、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶,、液氮或干冰容器
4,、步驟：
（1）操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管,，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程,，此時蓋子易松掉,。
（3）將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之,，移入無菌操作臺內(nèi),。
（4）取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi),。
（5）取出解凍之細胞懸浮液,，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。
（6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol),，依細胞種類而異,，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),，離心1000rpm，5分鐘,，移去上清液,，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。
（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基,。
三,、細胞計數(shù)與存活測試
1、原理：
（1）計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù),。
（2）血球計數(shù)盤一般有二個chambers,，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格,，深度均為0.1mm,。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml,。使用時,，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù),，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目,。
（3）存活測試之步驟為dyeexclusion,，利用染料會滲入si細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整,，染料無法滲入而不會呈色,。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue,，則用紅色之Erythrosin bluish,。計算細胞活率：活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+si細胞數(shù)）×*。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成,，隨時間延長,，部分活細胞也開始攝取染料；因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力,，用不含血清的稀釋液,，可以使染色計數(shù)更為準確,。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061),；Erythosin bluish stain,；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip),；計數(shù)器(counter),；低倍倒立顯微鏡；粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics),。白細胞稀釋液（4%乙酸溶液）,。
3、步驟：
（1）取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中,。
（2）取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入,，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察,，活細胞不染色,，si細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。
（3）計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù),，再除4,，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合),，zui后乘以104,，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上,，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞),。
注：4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
計數(shù)板計數(shù)時,，zui適濃度為5～10×105細胞/ml,，此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液,，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù),。
5、范例：
T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液,，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目,。
活細胞數(shù)/方格：55,，62，49,，59,；si細胞數(shù)/方格：5,，3，4,，6,；細胞總數(shù)=243
平均細胞數(shù)/方格=60.75；稀釋倍數(shù)=2,；
細胞數(shù)/ml：60.75×104×2（稀釋倍數(shù)）=1.22×106,；
細胞數(shù)/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
細胞凍存、解凍方法與細胞計數(shù)
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發(fā)布日期: 2006-08-14 11:28  文章來源: 丁香園 - 細胞技術(shù)討論版

關(guān)鍵詞: 細胞凍存  解凍  細胞計數(shù)

一,、細胞冷凍保存

1,、材料：

生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO（Sigma D-2650）,、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene　5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）,、血球計數(shù)盤與蓋玻片,、等速降溫機（KRYO10SeriesII）。

2,、冷凍保存方法：

（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase*儲存,。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大,，造成細胞大量si亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些,。

（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃,，再放在液氮槽vaporphase*儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存,。

3,、步驟：

（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形,。

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5～10％,，混合均勻,，置于室溫下待用。

（3）依細胞繼代培養(yǎng)之操作,，收集培養(yǎng)之細胞,，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。

（4）離心,，去除上清液,，加入適量冷凍保存溶液,，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻,，分裝于已標示*之冷凍保存管中,，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測,。

4,、注意事項：

（1）欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度,。

（2）冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

（3）注意冷凍保護劑之品質(zhì),。DMSO應(yīng)為試劑級等級,，無菌且無色（以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650）,，以5～10ml小體積分裝,，4℃避光保存，勿作多次解凍,。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因*儲存后對細胞會有毒性,。

（4）冷凍保存之細胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高,，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后si去,。
③adherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異,。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml,。

（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture,，以防止冷凍失敗。

二,、冷凍細胞活化

1,、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之si亡,。

2,、細胞活化后，約需數(shù)日,，或繼代一至二代,，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常（例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)）。

3,、材料 ：37℃恒溫水槽,、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶,、液氮或干冰容器 ,。

4、步驟：

（1）操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套,，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊,，由于熱脹冷縮過程,，此時蓋子易松掉。

（3）將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,，回溫后噴以70%酒精并擦拭之,，移入無菌操作臺內(nèi)。

（4）取出冷凍管,，立即放入37℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部,，移入無菌操作臺內(nèi),。

（5）取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例為1：10～1：15）,，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試,。

（6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol）,，依細胞種類而異，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護劑,。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),，離心1000rpm,，5分鐘,，移去上清液,，加入新鮮培養(yǎng)基,，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

（7）若不需立即去除冷凍保存劑,，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

三,、細胞計數(shù)與存活測試

1,、原理：

（1）計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。

（2）血球計數(shù)盤一般有二個chambers,，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形,，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm,。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后,，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時,，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目,，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104,，即為每ml中之細胞數(shù)目,。

（3）存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入si細胞中而呈色,，而活細胞因細胞膜完整,，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料,，如果細胞不易吸收trypan blue,，則用紅色之Erythrosin bluish。

2,、材料：

0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061）,；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish（SigmaE-9259）及0.05gram preservative methyl paraben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline,；血球計數(shù)盤及蓋玻片（Hemocytometerandcoverslip）,；計數(shù)器（counter）；低倍倒立顯微鏡,；粒子計數(shù)器（Coultercounter,CoulterElectronics）,。

3、步驟：

（1）取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue（orErythrosinbluish）等體積混合均勻于1.5ml小離心管中,。

（2）取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入,，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色,，無活性細胞則為藍色（或紅色-Erythrosin bluish）,。

（3）計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4,，乘以稀釋倍數(shù)（至少乘以2,，因與trypanblue等體積混合），zui后乘以104,，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù),。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞（或計下線與左線之細胞）,。

注：4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml,；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

4、范例：

T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液,，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目,。

活細胞數(shù)/方格：55,，62，49,，59,；無活性細胞數(shù)/方格：5，3,，4,，6；細胞總數(shù)=243

平均細胞數(shù)/方格=60.75,；稀釋倍數(shù)=2

細胞數(shù)/ml：60.75×104×2（稀釋倍數(shù)）=1.22×106

細胞數(shù)/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

存活率：225/243﹦92.6%...