支原體檢測試劑盒qPCR (經(jīng)典法)

Venor®Gem qEP

支原體qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記,，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光,，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監(jiān)測,，簡稱qPCR,。

支原體檢測試劑盒qPCR (經(jīng)典法)優(yōu)點：

①靈敏度高、特異性強,。

②時間短,，2-3小時出結果。

③檢測結果可定量,。

④操作簡便,。

缺點：

①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中,，PCR結果會出現(xiàn)假陽性,。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇,，盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用,。

支原體檢測試劑盒qPCR (經(jīng)典法)介紹

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細微差別,，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種,。

此兩類試劑盒較全球其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下*的優(yōu)點：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性,，一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）,，根據(jù)序列一致性，至少可以檢測到107種支原體物種,。操作簡單,，易于觀察。

（使用MB的試劑盒,，下表中列出的支原體物種均為陽性,，其他微生物或真核細胞均為陰性,，無交叉反應）

③高靈敏度，MB公司的經(jīng)典法試劑盒檢測限可達到≤10CFU/ml,。

MB公司的一步法qPCR試劑盒檢測限≥50個基因組/反應,。

④MB公司有相應配套的10CFU/100CFU的敏感度測試的標準品，便于方法學驗證,。

⑤MB公司有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA,，便于特異性驗證。

⑥MB公司有相應配套的支原體絕對定量標準品,，便于最后定量檢測,。

qPCR Kit (經(jīng)典法)特點：

1. 內控對照為獨立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程,。

2. 高特異性,，一次檢測即可涵蓋所有常見易感染細胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細菌和真核DNA無交叉反應,。

3. 高靈敏度,，檢測限可達到≤10CFU/ml。

4. 有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA,，便于特異性驗證,。

5.有相應配套的支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測,。

操作步驟：

第1步：樣本處理

a.細胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：

①樣品基質可能會影響檢測的靈敏度,。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶,，在低溫下也能降解支原DNA,，影響檢測靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理,，實現(xiàn)最高靈敏度,。

推薦：德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒

Venor® Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗證。

第2步：試劑制備

a. 凍干粉溶解

b. 反應體系制備

b1) 樣品為細胞上清篩查——反應體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應體系制備

第3步：啟動熒光定量PCR儀

第4步：結果判別

FAM通道：檢測支原體熒光信號,。HEX通道：檢測內控對照熒光信號,。

支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。

支原體DNA越多,，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低,。

定量需基于Ct值和DNA標準曲線,。

Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果,。

示意圖：

儲存條件

2~8℃保存至少12個月,。復溶后-18℃以下保存,。

效期

1年6個月