FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能強(qiáng)大全面的植物顯微熒光研究?jī)x器,，是基于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的顯微成像定制系統(tǒng),。它由包含可擴(kuò)展部件的增強(qiáng)顯微鏡、高分辨率CCD相機(jī),、激發(fā)光源組,、光譜儀、控溫模塊以及相應(yīng)的控制單元和的工作站與分析軟件組成,。它不僅可以進(jìn)行微藻,、單個(gè)細(xì)胞、單個(gè)葉綠體乃至基粒-基質(zhì)類囊體片段進(jìn)行Fv/Fm,、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng),、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線,、QA再氧化等各種葉綠素?zé)晒饧癕CF多光譜熒光（multicolor fluorescence）成像分析,；還能通過激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測(cè)量，從而進(jìn)行GFP,、DAPI,、DiBAC4、SYTOX,、CTC等熒光蛋白,、熒光染料以及藻青蛋白、藻紅蛋白,、藻膽素等藻類*熒光色素的成像分析,；更可以利用光譜儀對(duì)各種熒光進(jìn)行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團(tuán)（例如PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等）并進(jìn)行深入分析,。

  FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機(jī)理研究的探針,，使科研工作者在藻類和高等植物細(xì)胞與亞細(xì)胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發(fā)生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機(jī)理提供了為有力的工具,。FKM作為藻類/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器,，得到了學(xué)界的廣泛認(rèn)可并取得了大量的科研成果。

功能特點(diǎn)

•內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素?zé)晒庋芯康娜砍绦?，如Fv/Fm,、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅,、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線,、QA再氧化等，可獲得70余項(xiàng)參數(shù),。

•配備10倍,、20倍、40倍,、63倍和100倍生物熒光物鏡,，可以清晰觀測(cè)到葉綠體及其發(fā)出的熒光,。

•激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光,、藍(lán)光,、綠光、白光,、紫外光和遠(yuǎn)紅光等,，通過紅藍(lán)綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發(fā)色團(tuán),。

•可進(jìn)行GFP,、DAPI、DiBAC4,、SYTOX,、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

•高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖,。

•控溫系統(tǒng)可以保證實(shí)驗(yàn)樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測(cè)量,，提高實(shí)驗(yàn)精度，也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究,。

應(yīng)用領(lǐng)域

• 微藻,、大型藻類/高等植物的單個(gè)細(xì)胞、單個(gè)葉綠體,、基粒-基質(zhì)類囊體片段等的顯微結(jié)構(gòu)植物光合生理研究

• 藻類/植物逆境研究

• 生物和非生物脅迫的研究

• 藻類/植物抗脅迫能力及易感性研究

• 突變體篩選及光合機(jī)理研究

• 藻類長勢(shì)與產(chǎn)量評(píng)估

• 藻類*色素與光合作用關(guān)系

• 藻類/植物——微生物交互作用研究

• 藻類/植物——原生動(dòng)物交互作用研究

• 基因工程與分子生物學(xué)研究

測(cè)量樣品

• 植物活體切片

• 植物表皮

• 植物細(xì)胞

• 綠藻,、藍(lán)藻等各種單細(xì)胞和多細(xì)胞微藻

• 葉綠體提取液

• 類囊體提取液

• 含有葉綠體的原生動(dòng)物

工作原理

  FKM分析過程中，通過連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內(nèi)置在6位濾波輪中的一系列濾波器,、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團(tuán)的動(dòng)態(tài)熒光,。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和熒光動(dòng)力學(xué)成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接,，以進(jìn)行激發(fā)熒光光譜分析,。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機(jī)則用于熒光動(dòng)力學(xué)成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預(yù)先設(shè)定好的程序自動(dòng)進(jìn)行,。測(cè)量過程中,，可通過溫控模塊調(diào)控藻類、植物細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)樣品的溫度,。蠕動(dòng)泵可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)藻類的連續(xù)測(cè)量,。

儀器組成

1. 增強(qiáng)顯微鏡 

2. 高分辨率CCD相機(jī) 

3. 激發(fā)光源組 

4. SM 9000光譜儀 

5. 主控制單元 

6. 工作站及軟件 

7. 控溫模塊的控制單元

8. 6位濾波輪

技術(shù)參數(shù)

• 測(cè)量參數(shù)

?Fo, Fo’, Fs, Fm, Fm’, Fp, FtDn, FtLn, Fv, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,Fv',Ft,ΦPSII, NPQ_Dn, NPQ_Ln, Qp_Dn, Qp_Ln, qN, qP，QY, QY_Ln, Rfd, ETR等50多個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù),，每個(gè)參數(shù)均可顯示2維熒光彩色圖像

?OJIP快速熒光曲線：測(cè)定分析OJIP曲線與二十幾項(xiàng)相關(guān)參數(shù)包括：Fo,、Fj、Fi、P或Fm,、Vj、Vi,、Mo,、Area 、Fix Area,、Sm ,、Ss 、N（QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量）,、Phi¬¬¬_Po ,、Psi_o 、Phi_Eo,、Phi_Do,、Phi_pav、ABS/RC（單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量）,、TRo/RC（單位反應(yīng)中心初始捕獲光量子通量）,、ETo/RC（單位反應(yīng)中心初始電子傳遞光量子通量）、DIo/RC（單位反應(yīng)中心能量散失）,、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）,、TRo/CSo、RC/CSx（反應(yīng)中心密度）,、PIABS（基于吸收光量子通量的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)）,、PIcs（基于截面的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)）等（選配）

?GFP、DAPI,、DiBAC4,、SYTOX、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析（選配）

?QA再氧化動(dòng)力學(xué)曲線（選配）

?Spectrum熒光光譜圖（選配）

•具備完備的自動(dòng)測(cè)量程序（protocol）,，可自由對(duì)自動(dòng)測(cè)量程序進(jìn)行編輯

?Fv/Fm：測(cè)量參數(shù)包括Fo,，F(xiàn)m，F(xiàn)v,，QY等

?Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：Fo,，F(xiàn)p，F(xiàn)v,，F(xiàn)t_Lss,，QY，Rfd等熒光參數(shù)

?熒光淬滅分析：Fo,，F(xiàn)m,，F(xiàn)p，F(xiàn)s，F(xiàn)v,，QY,，ΦII，NPQ,，Qp,，Rfd，qL等50多個(gè)參數(shù),，2套制式程序

?光響應(yīng)曲線LC：Fo,，F(xiàn)m，QY,，QY_Ln,，ETR等熒光參數(shù)

?Dyes & FPs穩(wěn)態(tài)熒光成像測(cè)量

?OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)分析：Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積,、Sm（對(duì)關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）,、QY、PI等26個(gè)參數(shù)（選配）

?QA再氧化動(dòng)力學(xué)（選配）

?Spectrum熒光光譜分析（選配）

•熒光激發(fā)光源：紅外光,、紅光,、橙光、藍(lán)光,、綠光,、白光、紫外光等可選,，根據(jù)客戶要求定制光源組

•透射光源（選配）：白光,、遠(yuǎn)紅光

?高分辨率TOMI-2 CCD傳感器：

?逐行掃描CCD

?高圖像分辨率：1360×1024像素

?時(shí)間分辨率：在高圖像分辨率下可達(dá)每秒20幀

?A/D 轉(zhuǎn)換分辨率：16位（65536灰度色階）

?像元尺寸：6.45µm×6.45µm

?運(yùn)行模式：1）動(dòng)態(tài)視頻模式，用于葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)量,；2）快照模式,，用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測(cè)量

?通訊模式：千兆以太網(wǎng)

•顯微鏡：Axio Imager M2，可選配Axio Scope A1簡(jiǎn)潔版或Axio Imager Z2高級(jí)版

?物鏡轉(zhuǎn)盤：研究級(jí)7孔自動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤

?透射光快門

?聚光器 Achr Apl 0.9 H

?6位反光鏡轉(zhuǎn)盤

?雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)

?機(jī)械載物臺(tái)：75×50mm,，硬膜陽極氧化表面

?樣品架：76×26mm

•物鏡：10倍,、20倍、40倍,、63倍和100倍生物熒光物鏡（可選）

•6位濾波輪：葉綠素?zé)晒?、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等

•SM9000光譜儀

?入射狹縫：70µm×1400µm 

?光柵：平場(chǎng)型校正

?光譜范圍：200-980nm

?波長精確度：<0.5nm

?再現(xiàn)性：<0.1nm

?溫度漂移：<0.01nm/K

•溫度調(diào)控模塊：溫度調(diào)節(jié)范圍 5℃-70℃,，精確度0.1℃

•蠕動(dòng)泵（選配）：流速10-5600µl/min,，用于藻類連續(xù)培養(yǎng)測(cè)量

•FluorCam葉綠素?zé)晒獬上穹治鲕浖δ埽壕週ive（實(shí)況測(cè)試）、Protocols（實(shí)驗(yàn)程序選擇定制）,、Pre–processing（成像預(yù)處理）,、Result（成像分析結(jié)果）等功能菜單

•客戶定制實(shí)驗(yàn)程序協(xié)議（protocols）：可設(shè)定時(shí)間（如測(cè)量光持續(xù)時(shí)間,、光化學(xué)光持續(xù)時(shí)間、測(cè)量時(shí)間等）,、光強(qiáng)（如不同光質(zhì)光化學(xué)光強(qiáng)度,、飽和光閃強(qiáng)度、調(diào)制測(cè)量光等）,，具備實(shí)驗(yàn)程序語言和腳本,，用戶也可利用Protocol菜單中的向?qū)С绦蚰０孀杂蓜?chuàng)建新的實(shí)驗(yàn)程序

•自動(dòng)測(cè)量分析功能：可設(shè)置一個(gè)實(shí)驗(yàn)程序（Protocol）自動(dòng)無人值守循環(huán)成像測(cè)量，重復(fù)次數(shù)及間隔時(shí)間客戶自定義,，成像測(cè)量數(shù)據(jù)自動(dòng)按時(shí)間日期存入計(jì)算機(jī)（帶時(shí)間戳）

•快照（snapshot）模式：通過快照成像模式，可以自由調(diào)節(jié)光強(qiáng),、快門時(shí)間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩(wěn)態(tài)熒光和瞬時(shí)熒光圖片

•成像預(yù)處理：程序軟件可自動(dòng)識(shí)別多個(gè)植物樣品或多個(gè)區(qū)域,，也可手動(dòng)選擇區(qū)域（Region of interest，ROI）,。手動(dòng)選區(qū)的形狀可以是方形,、圓形、任意多邊形或扇形,。軟件可自動(dòng)測(cè)量分析每個(gè)樣品和選定區(qū)域的熒光動(dòng)力學(xué)曲線及相應(yīng)參數(shù),，樣品或區(qū)域數(shù)量不受限制（>1000）

•數(shù)據(jù)分析模式：具備“信號(hào)計(jì)算再平均”模式（算數(shù)平均值）和“信號(hào)平均再計(jì)算”模式，在高信噪比的情況下選用“信號(hào)計(jì)算再平均”模式,，在低信噪比的情況下選擇“信號(hào)平均再計(jì)算”模式以過濾掉噪音帶來的誤差

•輸出結(jié)果：高時(shí)間解析度熒光動(dòng)態(tài)圖,、熒光動(dòng)態(tài)變化視頻、熒光參數(shù)Excel文件,、直方圖,、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

葉綠素?zé)晒馀c光譜分析結(jié)果

典型應(yīng)用：

產(chǎn)地：捷克

參考文獻(xiàn)：

1.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

2.Konert G, et al. 2019. Protein arrangement factor: a new photosynthetic parameter characterizing the organization of thylakoid membrane proteins. Physiologia Plantarum 166: 264-277.

3.Exposito-Rodriguez M, et al. 2017. Photosynthesis-dependent H2O2 transfer from chloroplasts to nuclei provides a high-light signalling mechanism. Nature Communications, 8: 49

4.Higo S, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki, Japan. Harmful Algae, 61:63-70

5.Jacobs M, et al. 2016. Photonic multilayer structure of Begonia chloroplasts enhances photosynthetic efficiency. Nature Plants, doi:10.1038/nplants.2016.162

6.Andresen E, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol., 210(4):1244-1258

7.Thomas G, et al. 2016. Deficiency and toxicity of nanomolar copper in low irradiance—A physiological and metalloproteomic study in the aquatic plant Ceratophyllum demersum. Aquatic Toxicology, 177:226-236

8.Fujise L, et al. 2014. Moderate Thermal Stress Causes Active and Immediate Expulsion of Photosynthetically Damaged Zooxanthellae (Symbiodinium) from Corals. PLOS ONE,  DOI:10.1371/journal.pone.0114321

9.Gorecka M, et al. 2014. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 369(1640), DOI: 10.1098/rstb.2013.0234

10.Mishra S, et al. 2014. A different sequence of events than previously reported leads to arsenic-induced damage in Ceratophyllum demersum L. Metallomics, 6: 444-454

11.Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91

12.Andresen E, et al. 2013. Effects of Cd & Ni toxicity to Ceratophyllum demersum under environmentally relevant conditions in soft & hard water including a German lake. Aquatic Toxicology. 142–143, 15: 387–402