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程艷：      :

蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)

酶抑制率法（分光光度法）試劑  使用說明

本試劑為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)快速檢驗(yàn)方法GB/T5009.199-2003的配套試劑,。酶活性和對(duì)農(nóng)藥的靈敏度指標(biāo)均達(dá)到或超過了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，可以在各種型號(hào)的農(nóng)藥殘毒檢測(cè)儀（分光光度法）上使用,，具有穩(wěn)定性好,、靈敏度高和使用方便等特點(diǎn)。

一,、試劑配制

1. 緩沖液試劑：整包倒入大燒杯中,，加1000mL純凈水溶解，酸堿度為pH8.0，常溫保存,；

2. 乙酰膽堿酯酶：取一支酶粉加20mL緩沖溶液溶解,，4℃冰箱中保存，一周內(nèi)用完,。也可將溶解后的酶液分成幾個(gè)小瓶,，將其冷凍，用時(shí)融化,，但不能重復(fù)多次冷凍,、化解。

3. 顯色劑：取一支顯色劑加入20mL緩沖溶液,，避光保存,；

4. 底物：取一支底物加20mL緩沖溶液，搖勻后置4℃冰箱中保存,；

二,、分析步驟

1. 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土,，剪成1cm左右見方碎片,，取樣品1g，（非葉菜類取2g）放入燒杯或提取瓶中,，加入5mL緩沖溶液,，手搖振蕩1～2分鐘，或超聲波振蕩30秒鐘,，倒出提取液，靜置3~5min,，待用,。

2. 對(duì)照溶液測(cè)試： 先于試管中加入100微升酶液和100微升顯色劑，再加入2.5mL緩沖溶液,，搖勻后于37°C放置15min,，加入100微升底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng),，應(yīng)立即放入儀器比色池中,，記錄初始吸光度A₁和反應(yīng)3 min時(shí)的吸光度A₂，A₂-A₁=DA₀,。

3.樣品溶液測(cè)試：先于試管中加入100微升酶液和100微升顯色劑,，再加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同,，記錄初始吸光度A₁和反應(yīng)3 min時(shí)的吸光度A₂,，A₂-A₁=DA_t。

三、結(jié)果計(jì)算

結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示,。

抑制率（%）=[ （DA₀-DA_t）/ DA₀]×100 

當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率≥50%時(shí),，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果,。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上,。

對(duì)陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。

四、注意

1. 每批樣品的控制時(shí)間,、溫度條件必須與對(duì)照溶液的條件**,。

2. 蔥、蒜,、蘿卜、韭菜、芹菜,、香菜、茭白,、蘑菇及番茄汁液中,，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性,。處理這類樣品時(shí),，不要剪的太碎。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜,，也不要剪的太碎,。

3. 當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢,，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng),，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶對(duì)照溶液測(cè)試得到的吸光度A₂-A₁≥ 0.3以上,，即可往下操作,。當(dāng)對(duì)照溶液酶液的加入量大一些時(shí)，也可使A₂-A₁≥0.3以上,。

4. 當(dāng)吸光度大到無法讀取時(shí),，說明測(cè)定液渾濁有干擾。

五,、產(chǎn)品有關(guān)技術(shù)指標(biāo)

1. 代表性農(nóng)藥的檢出下限見下表

2. 乙酰膽堿酯酶的活性：（室溫20°C以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）DA₀≥0.3,。

六、包裝及保存條件

每包可做200份樣品,，0°C以下冰箱冷凍保質(zhì)期為三年,，配成試劑后保存期為一周