實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real Time Quantitative PCR）

熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)介紹：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng),、有效解決PCR污染問題,、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),，目前已得到廣泛應(yīng)用 。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置,，PCR擴(kuò)增和檢測同時(shí)進(jìn)行,，zui終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染,。

相對定量應(yīng)用（Relative Quantification,，RQ）    

特異性熒光標(biāo)記：

TaqMan法

TaqMan探針的特性：

（1）.5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），如FAM、VIC等

（2）.3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) （Quencher, Q）

（3）.探針完整,，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ,，無熒光， R與Q分開,，發(fā)熒光

（4）.Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性,，可水解探針

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量
內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因
在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定,，受環(huán)境因素影響小
內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量

相對定量分析方法1    2-ΔΔCt
前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
 1,、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
   ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test）
   ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator）
 2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：
        ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
 3,、計(jì)算表達(dá)水平比率：
                   2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值

服務(wù)流程

注意：客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同,，選擇從步驟1或2啟動(dòng)項(xiàng)目,。

我司分子生物學(xué)技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目包括：
       熒光定量PCR，反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測,；PCR產(chǎn)物克隆,，TA克隆，亞克??；RNAi干擾檢測；miRNA檢測,；質(zhì)粒載體構(gòu)建等