HPLC法測(cè)定谷物中黃曲霉毒素B1、G1,、B2,、G2含量

     摘 要 用一種快速方便的 真菌毒素多功能凈化柱處理樣品,然后用液相色譜對(duì)谷物中黃曲霉毒素B1、G1,、B2,、G2進(jìn)行測(cè)定。樣品經(jīng)乙腈-水（體積比84：16）提取,，提取液通過真菌毒素多功能凈化柱凈化,、濃縮，三氟乙酸（TFA）柱前衍生,，C18色譜柱分離,，熒光檢測(cè)器檢測(cè),，外標(biāo)法定量。對(duì)添加兩個(gè)濃度黃曲霉毒素的玉米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),，4種毒素的回收率均在90.44%～101.23%之間,，B1、G1,、B2,、G2的zui低檢測(cè)限分別為2.0、1.0,、0.5,、0.5ng/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，此法不僅定量準(zhǔn)確,，精密度高而且操作極為方便。

真菌毒素對(duì)糧食飼料的污染是一個(gè)性的問題,，我國(guó)因是農(nóng)業(yè)大國(guó)和人民以谷物為主食的飲食習(xí)慣,，使真菌毒素的污染問題顯得更為突出。黃曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一,，對(duì)世界上30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行的調(diào)查表明,，危害程度排在*位的是黃曲霉毒素。它是由黃曲霉,、寄生曲霉和集峰曲霉產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的化合物[1],，均為二呋喃香豆素（difuranocoumarin）的衍生物。雖然黃典霉毒素（AF）的衍生物有20多種,，目前已分離鑒定出的AF包括：AFB1,、AFB2、AFG1,、AFG2,、AFM1、AFM2,、AFP1,、AFQ、AFH1,、AFGM,、AFB2a和毒醇等12種，但天然污染糧油食品的AF是B組和G組兩大類,，即AFB1,、AFB2、AFG1和AFG2。黃曲霉毒素的毒性,，致突變及致癌作用已得到明確證實(shí),。它由強(qiáng)到弱的順序依次為AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2]。 歐盟的黃曲霉毒素的*AFB1是4μg/kg,。

    霉菌毒素的檢測(cè)定量一直是個(gè)難點(diǎn),，目前黃曲霉毒素檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法,、免疫親和柱凈化液相色譜法,。薄層色譜法操作繁瑣、污染大,、定量差,、耗時(shí)長(zhǎng)；而酶聯(lián)免疫法雖操作簡(jiǎn)單,、靈敏度高,，但特異性差；免疫親和柱液相色譜法是柱后衍生法,，它對(duì)于高黃曲霉毒素含量的樣品偏差較大,。且柱后衍生不普及,給使用帶來不便。本文所述方法用真菌毒素多功能凈化柱快速凈化,，液相柱前衍生法簡(jiǎn)單方便,，靈敏度和特異性高，又能避免氯仿等有毒試劑的使用,是一種值得推廣的好方法,。這種方法,，在上不少試驗(yàn)室已得到確認(rèn)，還被作為AOAC的*方法,。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

    乙腈（色譜純）,、甲醇（色譜純）、*（分析純）,、去離子水,、PuriToxSR160真菌毒素多功能凈化柱、液相色譜儀,、2475熒光檢測(cè)器。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

    標(biāo)準(zhǔn)品包括了黃曲霉毒素B1,、G1,、B2、G2各單一標(biāo)準(zhǔn)液和混合標(biāo)準(zhǔn)液,，溶劑為乙腈,，黃曲霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2,。單一標(biāo)準(zhǔn)液用來確定各自的保留時(shí)間,，具體工作用混合標(biāo)準(zhǔn)液是將所提供標(biāo)準(zhǔn)液稀釋10倍，用微量注射器分別取5.0,、10.0,、20.0、25.0,、40.0,、50.0μl稀釋標(biāo)準(zhǔn)液（具體濃度為200ng/ml的B1、G1,；50ng/ml的B2,、G2），和樣品一樣蒸干,，用三氟乙酸衍生,，定容于0.2ml流動(dòng)相，故所得進(jìn)針的濃度分別是：B1,、G1為5.0,、10.0、20.0,、25.0,、40.0、50.0ng/ml,；G2,、B2為1.25、2.5,、5.0,、6.25、10.0,、12.5ng/ml,。

1.3 樣品

    實(shí)驗(yàn)所用樣品包括玉米、小麥等,，取代表樣品5kg,，粉碎，充分混合均勻,，四分法縮至500g,。因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要,，必要時(shí)取樣量加大（有地方建議取15kg）,。

1.4 樣品的提取和凈化

    使用粉碎機(jī)將樣品研細(xì),，稱取25g研細(xì)樣品置于250ml的燒瓶或攪拌瓶中。加入100ml乙腈-水（體積比84：16）溶液,。在旋轉(zhuǎn)震蕩器上震蕩1h,。用漏斗、定性濾紙將其過濾到樣品瓶中,。轉(zhuǎn)移8ml樣品提取液通過PuriToxSR160真 菌毒素多功能凈化柱,，推出大約4ml的凈化液（具體過程見圖1），轉(zhuǎn)移2ml已凈化的提取液至潔凈的棕色瓶 ,。在水浴60℃條件下用氮?dú)獯蹈伞?/span>

1.5 柱前衍生及液相色譜條件

    向剩余物中加入200μl正己烷,、100μl三氟乙酸，立即旋緊蓋子,。渦旋30s,，在40℃烘箱中衍生15min，室溫下氮?dú)獯蹈苫旌衔?，?/span>200μl水-乙腈（體積比85：15）溶解殘余物并渦旋30s,，將其轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心試管中以10 000r/min的速度離心5min，把已經(jīng)制備凈化好的150μl樣品液轉(zhuǎn)移到HPLC樣品瓶,，進(jìn)樣25μl,。液相色譜條件見表1。

 2 結(jié)果與討論

2.1 4種黃曲霉毒素的分離情況

    取50μl黃曲霉毒素混標(biāo)工作溶液（濃度為B1,、G1 200ng/ml,；G2、B2 50ng/ml）于棕色瓶?jī)?nèi),，吹干,，衍生，流動(dòng)相定容,，經(jīng)液相色譜分離得出的標(biāo)準(zhǔn)色譜分離見圖2,。黃曲霉毒素G1、B1的濃度為50ng/mlG2,、B2的濃度為12.5ng/ml,。

 2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

    按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，4種黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,、回歸方程及檢出限（按3倍信噪比計(jì)算）的測(cè)定結(jié)果見圖3和表2,。

 2.3 樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

    取玉米樣品一份，分別做兩個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),。具體做法是：取8ml黃曲霉素空白樣的提取液,分別加10μl和 25μl黃曲霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液（1 000ng/ml黃曲霉素B1,、G1以及250ng/ml黃曲霉素B2、G2）作為加標(biāo),。經(jīng)過和樣品一樣的處理,得出其zui后的理論濃度見下式。

    ①B1、G1濃度：（0.010ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=12.5ng/ml,；

（0.025ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=31.25ng/ml,。

    ②B2、G2濃渡：

（0.010ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=3.125ng/ml,；

（0.025ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=7.812 5ng/ml,。

 2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

    按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理，對(duì)同一樣品連續(xù)測(cè)定5次,。

 2.5 樣品調(diào)查

    從市面上抽取10份玉米樣品,按此實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理,，結(jié)果為未檢出黃曲霉毒素。此方法簡(jiǎn)便易行,、快速準(zhǔn)確,、靈敏度高、檢測(cè)限低,，適合大批量檢測(cè),，值得推廣